HIF-1與線粒體呼吸鏈的關(guān)系及對(duì)細(xì)胞糖代謝的影響.pdf

1、目的:1.研究線粒體呼吸鏈和ATP、ROS等對(duì)HIF-1α的穩(wěn)定積聚的影響.2. 探討缺氧時(shí)HIF-1對(duì) Glut-1和GK及ATP產(chǎn)生的影響.材料和方法大鼠肝BRL細(xì)胞,以DMEM培養(yǎng)基加小牛血清培養(yǎng),分別分為正常對(duì)照組(21﹪O<,2>)(常氧組),缺氧組(1﹪O<,2>),各常氧和缺氧加阻斷劑組(碘乙酸、魚(yú)藤酮、抗霉素A、疊氮鈉、2,4-二硝基苯酚),常氧和缺氧分別加ATP、H<,2>O<,2>、谷胱甘肽組,常氧加吲哚美辛組、缺氧

2、組和缺氧加吲哚美辛組,缺氧4h.收獲細(xì)胞,分別行Western Blot 檢測(cè)各組的HIF-1α、Glut-1和GK蛋白;熒光檢測(cè)二乙酸二氯熒光素測(cè)定各組的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生;高效液相色譜法檢測(cè)ATP和能荷;免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位.RT-PCR檢測(cè)各組的Glut-1和GK的Mrna含量.酶學(xué)方法檢測(cè)GK的活性.結(jié)果:分別于常氧(21﹪O<,2>)和缺氧(1﹪ O<,2>)條件下以由低到高不同濃度魚(yú)藤酮、抗霉素和疊氮

3、鈉阻斷線粒體呼吸鏈復(fù)合體I、III和IV 4h,Western Blotting檢測(cè)HIF-1α蛋白,結(jié)果表明,缺氧時(shí)隨各阻斷劑濃度的增高,細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白量逐漸減少到基本無(wú)表達(dá);常氧情況下阻斷線粒體呼吸鏈復(fù)合體I、III和IV,與未阻斷一樣,無(wú)HIF-1α蛋白穩(wěn)定積聚.與常氧(21﹪O<,2>)對(duì)照組相比,缺氧(1﹪O<,2>)4h時(shí)細(xì)胞ATP和能荷明顯降低;常氧下采用碘乙酸阻斷糖酵解或分別以魚(yú)藤酮、抗霉素和疊氮鈉阻斷呼吸鏈復(fù)合

4、體I 、III 、IV 4h,細(xì)胞ATP和能荷較對(duì)照組明顯降低;缺氧時(shí)采用碘乙酸阻斷糖酵解或分別以魚(yú)藤酮、抗霉素和疊氮鈉阻斷呼吸鏈復(fù)合體I 、III 、IV 4h,細(xì)胞ATP和能荷均較單純?nèi)毖趺黠@降低.常氧情況下細(xì)胞有一定的ROS產(chǎn)生,缺氧4h時(shí)細(xì)胞的ROS產(chǎn)生減少,缺氧并應(yīng)用碘乙酸阻斷糖酵解或分別以魚(yú)藤酮、抗霉素和疊氮鈉阻斷呼吸鏈復(fù)合體I 、III 、IV 4h,細(xì)胞ROS產(chǎn)生更加減少.Western Blot 檢測(cè),BRL細(xì)胞常氧下

5、HIF-1α僅微量表達(dá),檢測(cè)呈陰性,缺氧4h時(shí)其表達(dá)明顯增加,缺氧同時(shí)以不同的濃度碘乙酸阻斷糖酵解,BRL細(xì)胞的HIF-1α產(chǎn)生穩(wěn)定與單純?nèi)毖跸啾容^無(wú)明顯改變.在常氧(21﹪O<,2>)和缺氧(1﹪ O<,2>)條件下應(yīng)用2,4-二硝基苯酚使氧化磷酸化解藕聯(lián),BRL細(xì)胞ATP和ROS產(chǎn)生減少.常氧(21﹪O<,2>)時(shí)應(yīng)用2,4-二硝基苯酚低濃度時(shí)對(duì)HIF-1α無(wú)影響,高濃度時(shí)可誘導(dǎo)HIF-1α的穩(wěn)定積聚.在缺氧(1﹪ O<,2>)條件

6、下低劑量應(yīng)用2,4-二硝基苯酚,使HIF-1α產(chǎn)生被抑制,高劑量時(shí)HIF-1α的產(chǎn)生增加.在常氧(21﹪O<,2>)和缺氧(1﹪ O<,2>)條件下分別在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入H<,2>O<,2>、ATP和谷胱甘肽對(duì)HIF-1α產(chǎn)生無(wú)明顯影響.免疫熒光檢測(cè)表明,常氧(21﹪O<,2>)時(shí)細(xì)胞有微量HIF-1α表達(dá)并核轉(zhuǎn)位.缺氧(1﹪ O<,2>)時(shí)HIF-1α的穩(wěn)定積聚增加,并大量核轉(zhuǎn)位;缺氧(1﹪ O<,2>)時(shí)應(yīng)用吲哚美辛抑制HIF-1α

7、穩(wěn)定積聚,細(xì)胞內(nèi)HIF-1α含量和核轉(zhuǎn)位明顯減少.RT-PCR檢測(cè)表明,單純?nèi)毖?1﹪ O<,2>)BRL細(xì)胞內(nèi)Glut-1和GK的Mrna較常氧(21﹪ O<,2>)時(shí)明顯增加.Western Blot檢測(cè)表明,單純?nèi)毖?1﹪ O<,2>)BRL細(xì)胞內(nèi)Glut-1和GK蛋白量較常氧(21﹪ O<,2>)時(shí)明顯增加.缺氧(1﹪ O<,2>)時(shí)以吲哚美辛抑制HIF-1α穩(wěn)定積聚后Glut-1和GK的Mrna增加受抑制.缺氧(1﹪ O<,2

8、>)時(shí)以吲哚美辛抑制HIF-1α穩(wěn)定積聚4h后,Glut-1和GK蛋白增加受到抑制.缺氧(1﹪ O<,2>)后GK活性明顯增強(qiáng).缺氧(1﹪ O<,2>)時(shí)以吲哚美辛抑制HIF-1α穩(wěn)定積聚4h后GK的活性較單純?nèi)毖鯇?duì)照組降低.缺氧(1﹪ O<,2>)時(shí)BRL細(xì)胞ATP產(chǎn)生減少,缺氧(1﹪ O<,2>)時(shí)以吲哚美辛抑制HIF-1α穩(wěn)定積聚4h時(shí)ATP 較對(duì)照組降低.結(jié)論:1. 在大鼠肝細(xì)胞(BRL),細(xì)胞單純?nèi)毖鯐r(shí)HIF-1α積聚和穩(wěn)定反