低氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響及HIF-1的作用機(jī)制.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)是具有高度自我更新能力和多項(xiàng)分化潛能的神經(jīng)前體細(xì)胞。它能最終分化形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，因此對(duì)治療神經(jīng)退行性疾病和損傷有著廣闊的應(yīng)用前景，目前已成為神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。而氧是生命存在的必要條件，也是細(xì)胞生理功能的一種重要調(diào)節(jié)因子，氧濃度的變化可影響細(xì)胞的功能狀態(tài)。目前關(guān)于低氧作用的研究多集中在低氧對(duì)細(xì)胞的損傷和有關(guān)的適應(yīng)機(jī)制方面，而關(guān)于低氧在細(xì)胞增殖和分化中的作用研究較少，特別是關(guān)于低氧對(duì)NSCs

2、增殖和分化的影響目前還不太清楚。低氧誘導(dǎo)因子一l(HIF—1)是細(xì)胞低氧反應(yīng)的核心調(diào)控因子，諸多研究表明它在腫瘤細(xì)胞增殖中起著重要的調(diào)控作用，但關(guān)于它是否參與低氧對(duì)NSCs增殖和分化的影響國內(nèi)外未見報(bào)道。因此本研究利用各種細(xì)胞分子生物學(xué)手段，比較了不同氧濃度對(duì)NSCs增殖和分化的影響，觀察了低氧后NSCs內(nèi)HIF-la的表達(dá)變化，并探討HIF一1α在低氧引起的NSCs增殖和分化中的作用。 一、神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定以及低氧濃

3、度測定 Wistar孕大鼠(E13．5d)戊巴比妥鈉麻醉后，無菌條件下取出胎鼠，分離胎鼠中腦NSCs。傳3代后，制成單細(xì)胞懸液，在涂有多聚賴氨酸(0．1mg／m1)的confocal皿中貼壁半小時(shí)，4％多聚甲醛固定后，用免疫組化進(jìn)行Nestin鑒定，鑒定結(jié)果表明幾乎所有細(xì)胞均為Nestin染色陽性，說明培養(yǎng)的NSCs較純，可用于下面的實(shí)驗(yàn)。 把通過以上方法得到的NSCs分別置于不同環(huán)境氧濃度中(20％02，10％02，3

4、％O2，0％O2)，培養(yǎng)3d后，分別用血?dú)夥治鰞x和自動(dòng)生化分析儀測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的氧分壓和乳酸濃度。氧分壓依次為153±7、105±5、80±10和65±15mmHg；乳酸濃度依次為O．875±0．251、L425±0．¨2、1．825±0．220和2．096±O．233mmol幾。由以上結(jié)果可以看出，隨著環(huán)境氧濃度的下降，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的氧分壓隨之下降，而乳酸濃度隨之增高，在環(huán)境氧濃度為O％02時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)上清的乳酸濃度達(dá)2．096

5、mmol／L。乳酸濃度過高不利于細(xì)胞生長，因此在以下的實(shí)驗(yàn)中，采用10％和3％氧濃度來觀察低氧對(duì)NSCs增殖和分化的影響。 二、低氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響及HIF-1的作用 細(xì)胞分組后分別置于常氧(20％02)和低氧(10％O2，3％02)環(huán)境中，培養(yǎng)3d后，采用神經(jīng)球記數(shù)、Brdu摻入和流式細(xì)胞術(shù)(測定增殖指數(shù))等方法觀察NSCs的增殖情況。神經(jīng)球記數(shù)結(jié)果表明：10％和3％的氧濃度可明顯促進(jìn)神經(jīng)球的形成，其增殖的神經(jīng)球

6、數(shù)目分別為常氧組的2．5和1．5倍；BrdU摻入結(jié)果表明，在低氧環(huán)境中BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)目明顯高于對(duì)照組；增殖指數(shù)結(jié)果表明，10％低氧組明顯高于對(duì)照組，而3％低氧組低氧早期增殖被抑制，經(jīng)過一段時(shí)間的適應(yīng)后，增殖指數(shù)有所增加，但仍不如10％低氧組明顯。 鑒于10％低氧促NSCs增殖作用更為明顯，因此我們觀察了10％低氧條件下NSCs內(nèi)HIF-1α的表達(dá)變化。RT-PCR結(jié)果表明：從低氧6h開始，HIF-1αmRNA水平比對(duì)照

7、組明顯增加；Westernblot分析結(jié)果表明：常氧條件下，幾乎檢測不到HIF-i~蛋白的表達(dá)，而低氧組在低氧6-72h內(nèi)都可以檢測到HIF-1α蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果提示，HIF-1可能在低氧促NSCs增殖中起著重要的調(diào)控作用。 為了進(jìn)一步證明HIF-1在低氧促NSCs增殖中的作用，用攜帶HIF-1α基因的Ad5腺病毒載體和針對(duì)HIF-I~mRNA的pSilencerTMU6／Neo／GFP／RNAi質(zhì)粒載體分別過表達(dá)和抑表達(dá)H

8、IF-1α，并觀察其對(duì)常氧或低氧條件下NSCs增殖的影響。增殖指數(shù)和細(xì)胞記數(shù)的結(jié)果表明：HIF一1α過表達(dá)可促進(jìn)常氧或低氧條件下NSCs的增殖；而抑制HIF一1α的表達(dá)可阻斷低氧條件下NSCs的增殖。由以上結(jié)果得出結(jié)論：HIF-1參與了低氧促NSCs增殖的調(diào)控；且HIF-1具有不依賴低氧的促NSCs增殖的作用。 三、低氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響及HIF-1的作用 取第三代神經(jīng)干細(xì)胞，分別置于常氧(20％02)和低氧(10％

9、02，3％02)條件下，在誘導(dǎo)液中培養(yǎng)3d后，各組記數(shù)種于涂膠皿并改用分化液，分化成熟5-7天后，用免疫組化、FACS和HPLC檢測NSCs的分化方向。組化和FACS結(jié)果表明，在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞與常氧組相比可分化為更多的神經(jīng)元和較少的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，從神經(jīng)元類型上看低氧可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向TH陽性神經(jīng)元方向分化，且以3％低氧條件下更為明顯；HPLC檢測培養(yǎng)上清中DA濃度的結(jié)果表明，10％低氧組與對(duì)照組無明顯差異，3％低氧組細(xì)胞培養(yǎng)

10、上清中DA的濃度比對(duì)照組明顯增加以上結(jié)果表明，低氧(3％)促進(jìn)NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向分化。 TH是轉(zhuǎn)錄因子HIF-1的靶基因，又是多巴胺合成過程中關(guān)鍵的限速酶，因此為了探討低氧(3％)促進(jìn)NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向分化的機(jī)制，觀察了3％低氧條件下NSCs內(nèi)HIF-I~的表達(dá)變化。RT-PCR結(jié)果表明：在低氧過程中，HIF一1αmRNA表達(dá)水平無明顯變化；Westernblot分析結(jié)果表明：常氧條件下，幾乎檢測不到HIF-

11、i~蛋白的表達(dá)，而低氧組在低氧3—72h內(nèi)都可以檢測到HIF-la蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果提示，HIF-1可能在低氧(3％)促進(jìn)NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向分化中起著重要的調(diào)控作用。 為了進(jìn)一步證明HIF-1在低氧促NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向分化中的作用，用攜帶HIF一1α基因的Ad5腺病毒載體過表達(dá)HIF-1α，觀察其對(duì)常氧或低氧條件下NSCs分化方向的影響。FACS和HPLC檢測結(jié)果表明：HIF-1α過表達(dá)可促進(jìn)常氧或低氧條件

12、下NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向分化。由以上結(jié)果得出結(jié)論：HIF-1參與了低氧條件下NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向的分化；且在常氧條件下HIF-1即可通過上調(diào)TH的表達(dá)來促進(jìn)NSCs向多巴胺能神經(jīng)元方向的分化。 綜上所述，低氧對(duì)NSCs的增殖和分化均有影響，且NSCs對(duì)不同低氧濃度的反應(yīng)是不一樣的。就增殖而言，10％O2促進(jìn)了NSCs的增殖，且HIF-1參與了其促NSCs增殖的調(diào)控；就分化而言，3％02促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向特別是