缺氧培養(yǎng)EPCs移植對缺血性心臟病的治療作用.pdf

1、目的：通過缺氧培養(yǎng)方法預(yù)處理骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(BM-EPCs，bone marrow endothelial progenitor cells)，探討缺氧培養(yǎng)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（BM-HEPCs，hypoxic preconditioned bone marrow endothelial progenitor cells）心肌內(nèi)移植治療缺血性心臟病的治療效果及潛在的分子生物學(xué)機(jī)制，為臨床細(xì)胞移植治療缺血性心臟病提供理論依據(jù)和策略參考。

2、　　內(nèi)容：以BM-HEPCs為研究對象，觀察缺氧培養(yǎng)方法對大鼠BM-EPCs細(xì)胞生物學(xué)功能的影響和潛在的分子生物學(xué)機(jī)制；研究基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1α（SDF-1α，Stromal cell-derived factor-1α）/CXCR4（CXCR4，CXC receptor-4）信號通路在BM-HPECs中發(fā)揮的作用；探討B(tài)M-HPECs移植后對心室重構(gòu)、心臟功能和血流動力學(xué)的影響；評估其對缺血性心臟病的治療效果。
　　方法：從8

3、周齡，體重250g～280g的同種系成年雄性Wistar大鼠長骨分離獲得大鼠BM-EPCs，Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL，Dil-acetylated low-density lipoproteins)和異硫氰酸鹽熒光素標(biāo)記的荊豆凝集素-1（FITC-UEA-1，fluorescein isothiocyanate-lectin from ulex europaeus-1）共同染色陽性，細(xì)胞表面白細(xì)胞分化抗原34（

4、CD，cluster of differentiation）/CD133表達(dá)陽性。將37℃、5％CO2+21%O2條件下培養(yǎng)至第4天的BM-EPCs，隨機(jī)分為4組，第一組為常規(guī)培養(yǎng)組，37℃、5%CO2+21%O2條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天；第二組為缺氧培養(yǎng)24h組，37℃、5%CO2+21%O2條件下繼續(xù)培養(yǎng)2天后，放入存滿1%O2+5%CO2+94%N2混合氣體的培養(yǎng)盒內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1天；第三組為缺氧培養(yǎng)48h組，37℃、5%CO2+21%O2

5、條件下繼續(xù)培養(yǎng)1天后，放入存滿1%O2+5%CO2+94%N2混合氣體的培養(yǎng)盒內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2天；第四組為缺氧培養(yǎng)72h組，放入存滿1%O2+5%CO2+94%N2混合氣體的培養(yǎng)盒內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3天，對以上各組細(xì)胞分別進(jìn)行抗凋亡檢測（Annexin V/PI），細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(Boyden Chamber Assay)，血管分化功能檢測（Matrigel Assay），實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR，reverse transcript

6、ase-polymerase chain reaction）檢測CXCR4，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT，serine/threonine-specific protein kinase），磷脂酰肌醇3激酶（PI3K，phosphatidyl Inositol3-kinase）和核因子-κB(NF-κB，nuclear factor-κB)信使核糖核酸（mRNA，Messenger Ribonucleic Acid）表達(dá)水平，應(yīng)用蛋

7、白印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot）檢測細(xì)胞表面SDF-1α受體CXCR4，Akt，PI3K蛋白表達(dá)情況。比較各組細(xì)胞生物學(xué)功能變化差異。8周齡，體重250g～280g的同種系成年雄性Wistar大鼠34只，隨機(jī)分為3組：對照組（Control，n=12），EPCs組（n=10）和HEPCs組(n=12),左心耳下緣2mm處結(jié)扎前降支，建立急性心肌梗塞動物模型。Control組：在心肌梗塞邊緣5個不同區(qū)域心肌內(nèi)注射PBS溶液200μl

8、；EPCs組：將2×106常規(guī)培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞稀釋于200μl PBS溶液中，在心肌梗塞邊緣5個不同區(qū)域心肌內(nèi)注射移植；HEPCs組：將2×106缺氧培養(yǎng)24h骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞稀釋于200μl PBS溶液中，在心肌梗塞邊緣5個不同區(qū)域心肌內(nèi)注射移植。4周后心臟超聲檢測心臟的形態(tài)學(xué)變化，壓力－容量曲線（P-V Loops，pressure-volume loops）分析評估實(shí)驗(yàn)動物血流動力學(xué)和心臟功能變化。
　　結(jié)果：BM-EPCs隨培

9、養(yǎng)時間延長,圓形或橢圓形細(xì)胞數(shù)目減少,梭形細(xì)胞數(shù)量增多,更換培養(yǎng)基后培養(yǎng)1天時出現(xiàn)細(xì)胞集落,3天開始出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特異性條索狀結(jié)構(gòu)。分離培養(yǎng)至第7天的大鼠BM-EPCs，Dil-acLDL和FITC-UEA-1雙熒光染色細(xì)胞陽性，CD34/CD133表達(dá)陽性。隨缺氧處理時間延長，BM-EPCs早期凋亡率明顯增加。與常規(guī)培養(yǎng)組相比，缺氧培養(yǎng)24 h組早期凋亡率改變不明顯（p>0.05），缺氧培養(yǎng)48 h組、72 h組，早期凋亡率明顯增加（p

10、<0.05）。以100ng/ml SDF-1α為趨化因子，比較常規(guī)條件和缺氧條件培養(yǎng) BM-EPCs的遷移能力，結(jié)果顯示缺氧培養(yǎng)24h組，大鼠BM-EPCs對SDF-1α的遷移明顯增加。隨缺氧處理時間的延長，BM-EPCs體外血管形成能力變化明顯。與常規(guī)培養(yǎng)組比較，缺氧培養(yǎng)24 h組的體外血管形成能力增強(qiáng)（p<0.01），缺氧培養(yǎng)48 h，72 h組體外血管形成能力明顯下降（p<0.01）；與缺氧培養(yǎng)24 h組比較，缺氧培養(yǎng)48 h，7

11、2 h組體外血管形成能力明顯下降（p<0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，與常規(guī)培養(yǎng)組相比較，缺氧培養(yǎng)24h組CXCR4，AKT，PI3K和NF-κB表達(dá)均具有顯著差異(p>0.05)。缺氧培養(yǎng)大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞24h，48h，72h后，Western Blot蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞表面SDF-1α受體CXCR4表達(dá)水平增高，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)通路蛋白AKT,PI3K表達(dá)水平增高。應(yīng)用ImageJ圖像處理軟件獲得蛋白印跡圖像密度灰度值進(jìn)行統(tǒng)計分析

12、，結(jié)果提示缺氧培養(yǎng)大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞24h，48h，72h后，CXCR4，AKT，PI3K表達(dá)水平與普通培養(yǎng)組相比明顯增加，缺氧培養(yǎng)24h組與缺氧培養(yǎng)48h和72h相比較，蛋白表達(dá)增強(qiáng)，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)動物細(xì)胞移植后4周，評估心臟形態(tài)及血流動力學(xué)指標(biāo)。EPCs組左室舒張末期直徑和收縮末期直徑與對照組相比在移植后顯著下降(p<0.05),而最大壓力、左室內(nèi)壓與左室內(nèi)壓變化速率比（dP/dtmax，the maximum first

13、 derivative of developed left ventricle pressure），左室容量與左室容量變化速率比（dV/dtmax，the maximum first derivative of developed left ventricle volume），心搏量和每分輸出量以及射血分?jǐn)?shù)則明顯提高(p<0.05)。相比之下，HEPCs組左室舒張末期容積和收縮末期容積與對照組相比在移植后同樣下降明顯,且最大壓力、dP/

14、dtmax，dV/dtmax，心搏量和每分輸出量以及射血分?jǐn)?shù)則明顯提高。此外，HEPCs組左室收縮末期直徑與EPCs組相比下降明顯，最大壓力、dP/dtmax，左室射血分?jǐn)?shù)則明顯提高。
　　結(jié)論：1%O2+5%CO2+94%N2缺氧培養(yǎng)大鼠BM-EPCs24h為缺氧預(yù)處理的最佳條件，缺氧培養(yǎng)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞上調(diào)細(xì)胞表面CXCR4，通過SDF-1α/CXCR4軸，PI3K/Akt細(xì)胞信號通路介導(dǎo)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增強(qiáng)發(fā)揮細(xì)胞生物學(xué)功效。H