小鼠酒精性脂肪肝中枯否細(xì)胞表型變化及ATF3-STAT3依賴的調(diào)控機(jī)制探討.pdf

1、酒精性肝?。ˋlcoholic Hepatitis）是一種長(zhǎng)期因大量飲酒從而導(dǎo)致的肝臟類疾病。通常脂肪肝為酒精性肝病的初期表現(xiàn)，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化。在我國(guó)，酒精性肝病目前是常見(jiàn)的肝臟疾病之一，給人民健康造成了嚴(yán)重的危害。近年來(lái)，在同期肝病住院患者中酒精性肝病所占的比例在不斷攀升，因此對(duì)酒精性肝病的研究就顯得尤其重要。枯否細(xì)胞（KCs）作為定居在肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞，在酒精性肝病的發(fā)病過(guò)程中起到了非常重要的作用。它具有吞

2、噬功能的同時(shí)又具有分泌功能，因此它可以利用多種途徑對(duì)肝臟造成損傷。由于巨噬細(xì)胞獨(dú)特的可塑性和異質(zhì)性，其可根據(jù)外在環(huán)境而發(fā)生功能和表型的改變。在巨噬細(xì)胞對(duì)外界做出應(yīng)答的過(guò)程中，作一個(gè)為“適應(yīng)響應(yīng)性”基因，細(xì)胞利用ATF-3（ATF/環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（ATF/ CREB）家族的轉(zhuǎn)錄因子3），以適應(yīng)外和/或細(xì)胞內(nèi)的變化。它可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的炎癥應(yīng)答的作用和相關(guān)的信號(hào)通路，如TLR4及NF-κB，來(lái)對(duì)炎癥起到一個(gè)負(fù)調(diào)控的

3、作用。
　　1．通過(guò)建立小鼠酒精性脂肪肝的模型，并采用肝臟原位灌流，分離出形態(tài)良好、具有生物學(xué)活性的枯否細(xì)胞（KCs），研究其在酒精性脂肪肝中的表型改變。
　　采用Lieber-DeCarli液體飲食加一次急性酒精灌胃，建立小鼠酒精性脂肪肝模型。造模周期為16天，于第16天灌胃9小時(shí)后處死小鼠，取小鼠肝臟及血清及KCs。檢測(cè)各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT/AST)，及肝勻漿及血清中總膽固醇/三酰甘油(TG/TC)水平

4、變化和肝臟病理切片 HE及油紅染色。選取原位灌流的方法分離KCs，流式細(xì)胞術(shù)分析肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞表型及組成的改變。熒光實(shí)時(shí)定量 PCR(q-PCR)檢測(cè)組織及提取細(xì)胞中各細(xì)胞因子水平。ALT/AST、TG/TC等反應(yīng)肝損傷的指標(biāo)模型組顯著高于對(duì)照組，HE及油紅染色結(jié)果與之一致，表明小鼠酒精性脂肪肝模型建立成功。肝臟原位灌流每只小鼠細(xì)胞得率約在1.5×106～2.0×106個(gè)。以小鼠巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記分子 F4/80及白細(xì)胞共同抗原 CD45

5、雙標(biāo)設(shè)門，流式細(xì)胞術(shù)分析F4/80和CD45雙陽(yáng)性細(xì)胞，在模型中肝臟固有CD68+細(xì)胞顯著降低，并出現(xiàn)大量的浸潤(rùn)單核細(xì)胞。q-PCR結(jié)果顯示，在肝組織及原代細(xì)胞中細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP-1）水平顯著升高。小鼠酒精肝模型建立成功，肝臟原位灌流法細(xì)胞得率較高，酒精性脂肪肝的發(fā)病可能與KCs構(gòu)成、表型改變，與細(xì)胞因子升高介導(dǎo)外周單核細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。
　　2．利用IFN-γ(

6、10 ng/ml)+LPS(10 ng/ml)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞6 h，IL-4(15 ng/ml)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞48 h，在細(xì)胞上建立M1及M2極化模型。
　　運(yùn)用Western blot和q-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)分型后的RAW264.7細(xì)胞，M1及M2各型標(biāo)志性蛋白iNOS，Arg1的表達(dá)水平。q-PCR檢測(cè)各組TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12

7、及IL-10表達(dá)水平。Western blot和q-PCR結(jié)果顯示，IFN-γ(10 ng/ml)+LPS(10 ng/ml)刺激6h后，M1型標(biāo)志性蛋白iNOS水平明顯升高，TNF-α、IL-6 mRNA水平也明顯升高；IL-4(15 ng/ml)刺激48h后，Arg1水平升高且TGF-β、IL-10 mRNA表達(dá)水平也明顯升高。與此同時(shí)，ELISA結(jié)果顯示M1型細(xì)胞上清中IL-12水平明顯升高，而M2型中IL-10水平也明顯升高。<

8、br>　　3.ATF3對(duì)于巨噬細(xì)胞極化的影響。
　　通過(guò)Western blot檢測(cè)小鼠酒精性脂肪肝模型肝組織中ATF3的表達(dá)。Western blot和q-PCR檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞ATF3，STAT3以及磷酸化STAT3的表達(dá)情況，用q-PCR檢測(cè)TGF-β、IL-10 mRNA表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12及 IL-10表達(dá)水平。利用LipofectamineTM2000將特異性 ATF3轉(zhuǎn)染到RA