大蒜油對小鼠酒精性脂肪肝防治作用的實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　 酒精對肝臟有明顯的毒性作用，酗酒是導(dǎo)致酒精性肝病(ALD)的首要因素。酒精性脂肪肝(AFLD)是ALD的一種早期表現(xiàn)，可以發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化，甚至酒精性肝硬化。近年來我國酒類產(chǎn)量不斷增加，酒精性脂肪肝在我國呈現(xiàn)逐年增多的趨勢，已成為一大醫(yī)學(xué)和社會問題。AFLD發(fā)病機制非常復(fù)雜，尚不完全清楚，目前臨床上無有效的治療藥物，因而研發(fā)能夠防治AFLD的藥物具有重要的意義。
　　 大蒜油為大蒜經(jīng)水蒸

2、氣蒸餾制得的一種揮發(fā)油，含有大蒜的主要的活性成分，包括二烯丙基硫、二烯丙基二硫、二烯丙基三硫、大蒜烯等多種含硫的功效成分。近年來的研究證實，大蒜油具有拮抗化學(xué)性肝損傷的作用。國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)：大蒜油能夠拮抗乙醇、四氯化碳以及對乙酰氨基酚引起的急性肝損傷，并且大蒜油能夠預(yù)防大鼠實驗性的非酒精性脂肪肝。因而大蒜油可能具有防治酒精性脂肪肝的功效。
　　 我們參考相關(guān)文獻，灌胃給予小鼠酒精輔以高脂飼料成功建立酒精性脂肪肝模型，通過觀察給

3、予大蒜油后各組小鼠的生化、病理等關(guān)鍵指標(biāo)，確定大蒜油是否對酒精性脂肪肝具有防治效果。并從機體抗氧化系統(tǒng)、肝臟CYP2E1的表達以及脂肪代謝等方面探討大蒜油防治酒精性脂肪肝的機理。
　　 研究方法：
　　 1．動物模型建立
　　 參考范建高等人的造模方法并加以改良。健康雄性昆明小鼠SPF級，18-22g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機分為酒精性脂肪肝模型組和正常對照組。模型組小鼠每天喂養(yǎng)高脂飼料(脂肪10％、膽固醇2％、基

4、礎(chǔ)飼料88％)。并給予3g/kg.bw的乙醇，正常組每天喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料并給予等體積的蒸餾水。造模3周后，生化及病理結(jié)果顯示確認造模成功。
　　 2．動物分組與處理
　　 2.1大蒜油預(yù)防小鼠酒精性脂肪肝
　　 健康雄性昆明小鼠（90只）SPF級，18-22g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后隨機分為正常對照組、模型組、大蒜油低劑量(20mg/kg)、中劑量(40mg/kg)、高劑量(80mg/kg)和凱西萊陽性藥物對照組(150m

5、g/kg)。除正常組每天喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料并給予等體積的蒸餾水外，其它各組小鼠每天喂養(yǎng)高脂飼料并給予3g/kg.bw的乙醇灌胃；大蒜油和凱西萊組分別于給予乙醇后6小時給予相應(yīng)劑量的大蒜油和凱西萊，正常組和模型組給予等體積蒸餾水，連續(xù)給藥三周。末次給藥后禁食12h，眼球取血分離血清，并取肝左葉凍存。
　　 2.2大蒜油治療小鼠酒精性脂肪肝
　　 將造模成功的小鼠（90只）隨機分為正常組、大蒜油低劑量(25mg/kg)、中劑量(5

6、0mg/kg)、高劑量(100mg/kg)、凱西萊(150mg/kg)和自然恢復(fù)組，每組15只。動物均給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，大蒜油和凱西萊組分別給予相應(yīng)劑量的大蒜油和凱西萊，正常組和自然恢復(fù)組給予等體積蒸餾水，連續(xù)給藥一周。末次給藥后禁食12h，眼球取血分離血清，并取肝左葉凍存。
　　 3．大蒜油防治酒精性脂肪肝的效果評價
　　 計算肝體比值；測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性及甘油三酯(TG)和膽固醇(

7、TC)的含量；制備肝臟勻漿，測定肝臟TG、TC和FFA含量；制備肝臟冰凍切片，蘇丹染色，觀察脂肪蓄積情況。
　　 4．大蒜油對機體抗氧化系統(tǒng)的影響
　　 稱取適量肝組織，制備10％肝組織勻漿，利用試劑盒測定肝勻漿中丙二醛(MDA)和還原性谷胱甘肽(GSH)的含量，以及超氧化物歧化酶(SOD)。
　　 5．大蒜油對肝臟細胞色素P4502E1(CYP2E1)蛋白水平的影響
　　 取適量肝組織，用RIPA裂解液

8、提取總蛋白，WesternBlot技術(shù)測定CYP2E1蛋白表達。
　　 研究結(jié)果：
　　 1．大蒜油預(yù)防小鼠酒精性脂肪肝
　　 1.1血清ALT和AST變化
　　 與正常組相比，模型組小鼠血清ALT和AST的活性分別增加了41.64％(P＜0.01)和51.80％(P＜0.01)；與模型組相比，大蒜油組(20，40，80mg/kg)小鼠血清ALT活性分別下降了10.10％、10.84％和12.43％(P＜

9、0.05);AST活性分別下降了22.34％、22.66％和25.80％(P＜0.01)；凱西組ALT和AST的活性亦有所下降，但不如大蒜油組明顯。
　　 1.2血清TG和TC的變化
　　 與正常組相比，模型組小鼠血清TG和TC的含量分別增加了86.60％(P＜0.01)和41.64％(P＜0.01);與模型組相比，大蒜油組（20，40，80mg/kg）和凱西萊組小鼠血清TG含量分別下降了14.92％(P＜0.01)、2

10、1.55％(P＜0.01)、33.15％(P＜0.01),和11.05％(P＜0.01)；TC含量分別下降了15.38％(P＜0.01)、18.90％(P＜0.01)、22.42％(P＜0.01)和23.30％(P＜0.01)。
　　 1.3肝組織TG和TC的變化
　　 與正常組相比，模型組小鼠肝組織TG、TC的含量顯著升高了301.31％(P＜0.01）和383.33％(P＜0.01);與模型組相比，大蒜油組(20，4

11、0，80mg/kg)和凱西萊組小鼠肝組織TG、TC含量明顯降低，TG含量分別下降了23.12％(P＜0.01)、24.27％(P＜0.01)、27.85％(P＜0.01)和24.10％(P＜0.01),TC含量分別下降了12.93％、22.70％(P＜0.05)、25.00％(P＜0.01)和21.84％(P＜0.01)。
　　 1.4肝組織FFA的變化
　　 與正常組相比，模型組小鼠FFA含量顯著增加了89.25％(P

12、＜0.01)；與模型組相比，大蒜油組(20，40，80mg/kg)和凱西萊組小鼠肝組織FFA的含量明顯降低，分別降低了25.13％(P＜0.01)、34.89％(P＜0.01)、1.13％(P＜0.01)和31.79％(P＜0.01)。
　　 1.5肝組織和血清MDA的變化
　　 與正常組相比，模型組小鼠肝組織和血清MDA的水平顯著升高了183.33％和39.11％(P＜0.01);與模型組相比，大蒜油組(20，40，8

13、0mg/kg)小鼠的肝組織MDA的水平分別下降了53.48％(P＜0.01)、57.75％(P＜0.01)和60.96％(P＜0.01)，血清MDA的水平分別下降了15.52％(P＜0.01)、19.46％(P＜0.01)和26.27％(P＜0.01)，凱西萊組較模型組小鼠肝組織和血清MDA的水平分別下降了43.85％(P＜0.01)和24.63％(P＜0.01)。
　　 1.6肝組織GSH的變化
　　 與正常組相比，模

14、型組小鼠肝組織GSH水平顯著下降了50％（P＜0.01）；與模型組相比大蒜油組(20，40，80mg/kg)小鼠肝組織的GSH水平有所提高，其水平分別提高了16.67％、33.33％和100％(P＜0.01)。凱西萊組小鼠GSH的水平較模型組無明顯增加。
　　 1.7肝組織SOD的變化
　　 與正常組相比，模型組小鼠肝組織SOD水平顯著下降了27.69％(P＜0.01)；與模型組相比，大蒜油組(20，40，80mg/kg

15、)和凱西萊組小鼠肝組織的SOD水平有所提高，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 1.8肝臟形態(tài)學(xué)改變
　　 肝臟冰凍切片蘇丹Ⅲ染色結(jié)果顯示，正常組未見脂滴，模型組有大量的橙黃色脂滴蓄積，大蒜油三個劑量組脂滴均明顯減少變小。
　　 1.9肝組織胞漿CYP2E1的變化
　　 與正常組相比，模型組小鼠肝臟中CYP2E1的蛋白水平增加了72.00％(P＜0.01)；與模型組相比大蒜油組(20，40，80mg/kg)小鼠

16、肝組CYP2E1的蛋白水平顯著下降，其水平分別下降了43.60％(P＜0.01)、63.95％(P＜0.01)和76.16％(P＜0.01)。凱西萊組與模型組相比無明顯變化。
　　 2．大蒜油治療酒精性脂肪肝
　　 2.1酒精性脂肪肝模型的建立
　　 與正常組相比，自然恢復(fù)組小鼠肝組織TG含量增加了259.31％，肝體指數(shù)增加了58.87％，肝臟冰凍切片蘇丹Ⅲ染色結(jié)果顯示，正常對照組未見脂滴，自然恢復(fù)組有大量的橙

17、黃色脂滴蓄積，呈現(xiàn)重度脂肪變性。
　　 2.2血清ALT和AST變化
　　 與正常組相比，自然恢復(fù)組小鼠血清ALT和AST的水平分別增加了30.29％(P＜0.01)和4.48％；與自然恢復(fù)組相比，大蒜油組(25，50，100mg/kg)小鼠血清ALT的水平分別下降了7.21％、16.22％(P＜0.05)和20.71％(P＜0.01);AST活性分別下降了2.82％、5.57％和8.72％；凱西萊組小鼠血清ALT、AS

18、T的水平分別下降了9.91％和1.64％。
　　 23血清TG和TC的變化
　　 與正常組相比，自然恢復(fù)組小鼠血清TG和TC的含量分別增加了52.75％(P＜0.01)和45.81％(P＜0.01);與自然恢復(fù)組相比，大蒜油組(25，50，100 mg/kg)和凱西萊組小鼠血清TG含量分別下降了20.14％(P＜0.01)、27.34％(P＜0.01)、31.65％(P＜0.01)和20.86％(P＜0.01)，TC含量

19、分別下降了19.25％(P＜0.01)，20.61％(P＜0.01)、22.97％(P＜0.01)和25.34％(P＜0.01)。
　　 2.4肝組織TG和TC的變化
　　 與正常組相比，自然恢復(fù)組小鼠肝組織TG、TC的含量顯著了升高了241.06％(P＜0.01)和147.22％(P＜0.05);與自然恢復(fù)組相比，大蒜油組(25，50，100mg/kg)小鼠肝組織TG含量分別下降了22.91％(P＜0.01)、25.8

20、3％(P＜0.01)、32.43％(P＜0.01)，TC含量有所下降，但與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；凱西組組較模型組TG、TC的含量有所降低但不如大蒜油明顯。
　　 2.5肝組織FFA的變化
　　 與正常組相比，自然恢復(fù)組小鼠FFA含量顯著增加了115.55％(P＜0.01);與自然恢復(fù)組相比，大蒜油組(25，50，100mg/kg)和凱西萊組小鼠肝組織FFA的含量明顯降低，分別下降了22.79％(P＜0.01)、21

21、.63％(P＜0.01)、28.36％P＜0.01）和25.28％(P＜0.01)。
　　 2.6肝組織和血清MDA的變化
　　 與正常組相比，肝組織和血清MDA分別升高了41.57％(P＜0.01)和16.40％;與自然恢復(fù)組相比，大蒜油組(25，50，100mg/kg)小鼠肝組織MDA分別下降了7.94％、11.11％和27.78(P＜0.01)％，血清MDA分別下降了4.93％、7.22％和12.26％;與自然恢復(fù)

22、組相比，凱西萊組肝組織和血清MDA分別下降了5.56％和3.78％。
　　 2.7肝組織GSH的變化
　　 與正常組相比，自然恢復(fù)組小鼠肝組織GSH水平顯著下降了36.84％（P＜0.01）；與自然恢復(fù)組相比，大蒜油組(25，50，100mg/kg)和凱西萊組小鼠肝組織的GSH水平有所提高，其水平分別提高了91.67％(P＜0.01)、108.33％(P＜0.01)、141.67％(P＜0.01)和33.33％。

23、　　 2.8肝組織SOD的變化
　　 與正常組相比，自然恢復(fù)組的肝組織SOD水平顯著下降了8.75％(P＜0.01）；與自然恢復(fù)組相比，大蒜油組(25，50，100mg/kg)和凱西萊組小鼠肝組織的SOD水平分別提高了12.58％(P＜0.01)、12.81％(P＜0.01)、15.43％(P＜0.01)和7.73％。
　　 2.9肝臟形態(tài)學(xué)改變
　　 肝臟冰凍切片蘇丹Ⅲ染色結(jié)果顯示，正常對照組未見脂滴，自然恢

24、復(fù)組有大量的橙黃色脂滴蓄積，大蒜油三個劑量組脂滴均明顯減少變小。
　　 2.10肝組織胞漿CYP2E1蛋白表達的變化
　　 與正常組相比，自然恢復(fù)組小鼠肝臟中CYP2E1的蛋白水平增加了58.00％(P＜0.01);與自然恢復(fù)組相比，大蒜油組（25，50，100mg/kg）小鼠肝組CYP2E1的蛋白水平顯著下降，其水平分別下降了23.42％(P＜0.01)，44.94％(P＜0.01)和52.23％(P＜0.01)；凱西