虎杖苷對非酒精性脂肪肝保護作用及機制研究.pdf

1、背景
　　 非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的,以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征,包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化和肝硬化。各種因為使肝內(nèi)脂肪堆積超過5％或肝活檢中發(fā)現(xiàn)單位肝細胞有1/3以上有脂肪滴被稱為脂肪肝。
　　 NAFLD發(fā)病率在不同國家也各有不同,其發(fā)病率在不同國家

2、也各有不同,目前西方國家約為20-30％,亞太地區(qū)約為12％～24％；兒童發(fā)病率約2.6％,肥胖兒童可達52.8％。隨著我國經(jīng)濟條件的改善,人民生活水平不斷提高,飲食結(jié)構(gòu)、工作的環(huán)境及方式的改變,NAFLD發(fā)病率明顯增加,而且有年輕化趨勢。資料顯示在我國上海市和廣東省NAFLD患病率分別已達到15.4％、11.7％。有資料顯示在排除其他肝病后,NAFLD通常是無癥狀轉(zhuǎn)氨酶升高的最主要因為,約占90％。單純性脂肪肝(NAFL)有12-40

3、％患者在8-13年內(nèi)進展為NASH,后可發(fā)展為肝硬化,與其他肝病引起的肝硬化患肝癌危險性無明顯差異。此外,還與肥胖、2型糖尿病、高動脈壓癥、高脂血癥等代謝綜合征密切相關(guān)。NAFLD已經(jīng)成為病毒性肝炎之后第二大慢性肝病,實行肝移植的第三大適應(yīng)癥。NAFLD的總死亡率比普通人顯著增高。防治本病已成為全球普遍關(guān)注的醫(yī)學(xué)和社會問題。
　　 非酒精性脂肪肝屬中醫(yī)“肥胖”“脅痛”“黃疸”等病范疇。多由過食肥甘厚味,濕熱蘊藉中焦,濕熱阻滯,氣

4、機受阻,氣血運行不暢,而瘀血內(nèi)生。病理關(guān)鍵在“濕(痰)”“熱”“瘀”?；⒄裙δ芮鍩帷⒗麧?、破瘀,作用于NAFLD關(guān)鍵病理因素,自古為中醫(yī)家治療“肥胖”“脅痛”“黃疸”等病的要藥,虎杖苷為中藥虎杖的主要活性成分之一,資料顯示在降脂、保護肝細胞等方面有一定效果,本實驗旨在用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段系統(tǒng)觀察其療效,并深入探討其可能的作用靶點,為臨床更確切廣泛使用虎杖提供科學(xué)依據(jù),為從中草藥中開發(fā)治療NAFLD藥物作探索性研究。
　　 目的<

5、br>　　 1觀察虎杖苷對非酒精性脂肪肝早期大鼠的影響,包括在體重、肝重、肝細胞脂肪變、肝功能、血脂代謝的影響。
　　 2、研究虎杖苷治療非酒精性脂肪肝的可能作用機制,包括氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及過氧化物酶體增殖激活物受體-α(PPAR-α)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)、肝X受體-α(LXR-α)、蛋白及基因表達的影響。
　　 方法:
　　 雄性SPF級SD大

6、鼠44只,體重200±10g,正常喂養(yǎng)1周后,完全隨機法分為2組,正常組對照(A,8只)和模型組(M,36只),組間大鼠體重差異無顯著性(P>0.05)。正常組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料,模型組給予高脂飼料(88％標(biāo)準(zhǔn)飼料+10％豬油+2％膽固醇)喂養(yǎng),自由飲水和進食,動物房保持安靜,自然采光,溫度25℃左右,喂養(yǎng)持續(xù)8周,分別從正常對照組和空白模型組隨機挑選一只,取肝臟做病理切片,證實非酒精性脂肪肝形成。再將模型組完全隨機法分為5組:空白模型組(B

7、)、虎杖苷高劑量組(C1)、虎杖苷中劑量組(C2)、虎杖苷低劑量組(C3)、非諾貝特組(D),每組7只。
　　 8周后,A組、B組予以生理鹽水灌胃,1ml/100kg.d,C1、C2、C3分別以160mg/kg.d、80 mg/kg.d、40 mg/kg.d虎杖苷混懸液灌胃,D組以100 mg/kg.d非諾貝特混懸液灌胃。持續(xù)4周。第12周末取大鼠血清及肝組織樣本,稱體重,肝濕重,計算肝指數(shù),全自動生化儀測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AL

8、T、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C),游離脂肪酸(FFA)；酶法測定空腹血糖(FBG)；放免法檢測血清空腹胰島素(FIN),計算胰島素抵抗指數(shù)(IRI),胰島素敏感指數(shù)(ISI)；對肝組織進行病理學(xué)檢查,HE染色觀察其脂肪變程度；酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)；蛋白免疫印跡法(western blotting)檢測PPAR-α、L

9、XR-α、SREBP-1c蛋白表達；實時熒光定量(real-time PCR)檢測PPAR-α、LXR-α、SREBP-1c基因表達。
　　 計量資料結(jié)果以(x)±s表示,兩組間比較采用t-test。多組間比較采用One wayANOVA,首先對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗,方差齊則用LSD法進間兩兩比較,如果數(shù)據(jù)方差不齊,則采用Welch法進行方差分析,應(yīng)用Dunnett T3法進行兩兩比較。等級資料資料采用Kruskal-Walli

10、s H非參數(shù)檢驗進行分析,P<0.05為有顯著性差異。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果
　　 第一部分:虎杖苷對非酒精性脂肪肝藥效研究
　　 1.根據(jù)肝臟病理狀態(tài),可見彌漫性肝細胞大泡樣脂肪變,無明顯炎癥、壞死及纖維化,NAFLD大鼠早期單純性脂肪肝階段模型復(fù)制成功。
　　 2.與空白模型組相比,虎杖苷高劑量組體重明顯減低(P<0.01),增長速度較慢,肝臟體減小,肝濕重減輕

11、,肝指數(shù)明顯降低(P<0.01)。肝臟病理顯示,虎杖苷高、中劑量組大鼠肝細胞脂肪沉積明顯減少(P<0.01),肝細胞形態(tài)、排列均明顯好轉(zhuǎn)。
　　 3.與空白模型組相比,虎杖苷高、中劑量組大鼠血清ALT明顯降低(P<0.01,P<0.05),虎杖苷高劑量組明顯優(yōu)于非諾貝特組(P<0.05)；虎杖苷高、中劑量組大鼠血清TG降低(P<0.01,P<0.05); 虎杖苷高劑量組大鼠血清TC、LDL-C降低(P<0.05,P<0.01),

12、HDL-C升高(P<0.01)?；⒄溶崭鲃┝拷M均能降低FFA(P<0.01)。
　　 第二部分:虎杖苷治療NAFLD部分機制研究
　　 1.與正常對照組比較,空白模型組大鼠總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)明顯減低(P<0.01),與空白模型組比較,虎杖苷高、中劑量組均能增高肝組織T-AOC、SOD、GST,同時降低肝組織MDA(P<0.01),其中虎杖苷高劑量組提高肝臟抗

13、氧化能力效果均優(yōu)于非諾貝特組(P<0.01)。
　　 2.與正常對照組比較,空白模型組大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)明顯增高(P<0.01),IRI增高,ISI明顯降低(P<0.01,P<0.05)。與空白模型組比較,虎杖苷高、中劑量組及非諾貝特組能降低FBG、FIN(P<0.01,P<0.05),減低胰島素抵抗指數(shù)(IRI),增高胰島素敏感指數(shù)(ISI)(P<0.01,P<0.05),其中虎杖苷高劑量效果均明顯優(yōu)

14、于優(yōu)于非諾貝特組(P<0.01,P<0.05)?；⒄溶盏蛣┝扛髦笜?biāo)與空白模型組無差異(P>0.05)。虎杖苷高、中劑量組在降低IRI,增加ISI效果優(yōu)于虎杖苷低劑量組(P<0.01)。
　　 3.與正常對照組比較,空白模型組大鼠血清TNF-α明顯高于(P<0.01),與空白模型組相比,虎杖苷高、中劑量組及非諾貝特組均能明顯降低血清TNF-α含量。
　　 結(jié)果
　　 第一部分:虎杖苷對非酒精性脂肪肝藥效研究

15、　　 1.根據(jù)肝臟病理狀態(tài),可見彌漫性肝細胞大泡樣脂肪變,無明顯炎癥、壞死及纖維化,NAFLD大鼠早期單純性脂肪肝階段模型復(fù)制成功。
　　 2.與空白模型組相比,虎杖苷高劑量組體重明顯減低(P<0.01),增長速度較慢,肝臟體減小,肝濕重減輕,肝指數(shù)明顯降低(P<0.01)。肝臟病理顯示,虎杖苷高、中劑量組大鼠肝細胞脂肪沉積明顯減少(P<0.01),肝細胞形態(tài)、排列均明顯好轉(zhuǎn)。
　　 3.與空白模型組相比,虎杖苷高、中

16、劑量組大鼠血清ALT明顯降低(P<0.01,P<0.05),虎杖苷高劑量組明顯優(yōu)于非諾貝特組(P<0.05)；虎杖苷高、中劑量組大鼠血清TG降低(P<0.01,P<0.05); 虎杖苷高劑量組大鼠血清TC、LDL-C降低(P<0.05,P<0.01),HDL-C升高(P<0.01)。虎杖苷各劑量組均能降低FFA(P<0.01)。
　　 第二部分:虎杖苷治療NAFLD部分機制研究
　　 1.與正常對照組比較,空白模型組大鼠

17、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)明顯減低(P<0.01),與空白模型組比較,虎杖苷高、中劑量組均能增高肝組織T-AOC、SOD、GST,同時降低肝組織MDA(P<0.01),其中虎杖苷高劑量組提高肝臟抗氧化能力效果均優(yōu)于非諾貝特組(P<0.01)。
　　 2.與正常對照組比較,空白模型組大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)明顯增高(P<0.01),IRI增高,ISI明顯降

18、低(P<0.01,P<0.05)。與空白模型組比較,虎杖苷高、中劑量組及非諾貝特組能降低FBG、FIN(P<0.01,P<0.05),減低胰島素抵抗指數(shù)(IRI),增高胰島素敏感指數(shù)(ISI)(P<0.01,P<0.05),其中虎杖苷高劑量效果均明顯優(yōu)于優(yōu)于非諾貝特組(P<0.01,P<0.05)?；⒄溶盏蛣┝扛髦笜?biāo)與空白模型組無差異(P>0.05)?；⒄溶崭?、中劑量組在降低IRI,增加ISI效果優(yōu)于虎杖苷低劑量組(P<0.01)。