Toll樣受體5與黏附侵襲性大腸桿菌LF82在炎癥性腸病發(fā)病中的作用研究.pdf

1、【背景和目的】
　　近年來炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的發(fā)病一直呈上升趨勢,但是病因不明,發(fā)病機制尚不清楚,且難以徹底治愈,嚴(yán)重影響生命健康。一般認(rèn)為感染、環(huán)境等因素觸發(fā)了遺傳易感個體異常的腸道免疫反應(yīng),引起腸道持續(xù)的炎癥和組織破壞。腸道菌群作為重要的致病因素,直接或間接地參與了包括IBD在內(nèi)的諸多消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。其中黏附侵襲性大腸桿菌(adherent-invasive Es

2、cherichia coli,AIEC)是近年來受到廣泛關(guān)注的一種IBD可能致病菌,最具代表性的AIEC菌株是E.coli LF82。AIEC在IBD發(fā)生發(fā)展中的作用和機制尚未闡明,尤其其是否與機體的某些免疫異常狀態(tài)存在協(xié)同作用共同促進IBD的發(fā)病尚不清楚。Toll樣受體(Toll-like receptors-5)是能直接識別病原菌分子結(jié)構(gòu)的一類模式識別受體,在機體抵御病原菌入侵的過程中起著重要作用。其中Toll樣受體-5(Toll-

3、like receptors-5,TLR5)可識別細(xì)菌鞭毛蛋白并與之結(jié)合,激活核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB),進而刺激大量炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生,但TLR5參與炎癥反應(yīng)的具體機制還有待進一步研究。本研究旨在明確AIEC菌株E.coli LF82在體外腸上皮屏障及體內(nèi)的作用,并探討TLR5在此過程中扮演的角色

4、及可能的分子機制,從而為闡明特殊類型的腸道大腸桿菌在IBD發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1.利用 Caco-2細(xì)胞系模型建立體外腸上皮屏障,通過測定跨上皮細(xì)胞電阻(trans epithelial electrical resistance,TEER)觀察E.coli LF82對屏障完整性的影響,測定熒光黃通過率研究E.coli LF82對腸屏障通透性的影響,通過免疫熒光化學(xué)和Western blot觀

5、察E.coli LF82對細(xì)胞間緊密連接的影響,通過ELISA研究E.coli LF82對細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥細(xì)胞因子的影響;
　　2.建立葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)C57BL/10C小鼠實驗性結(jié)腸炎模型,造模前一周向?qū)嶒瀯游锕辔附o予109CFU/天E.coli LF82,通過疾病活動性評價指標(biāo)、組織學(xué)表現(xiàn)、結(jié)腸組織MPO活性研究比較E.coli LF82對IBD實驗動物的結(jié)腸炎癥作用,

6、通過透射電鏡和免疫熒光化學(xué)觀察小鼠結(jié)腸超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架的變化,通過糖原染色、天狼星紅染色分別評估小鼠粘液產(chǎn)生能力和纖維化程度,通過Bio-plex、實時定量PCR和Western blot測定血清、組織中炎癥細(xì)胞因子及炎癥反應(yīng)通路相關(guān)分子的變化,通過免疫組織化學(xué)和Western blot檢測實驗小鼠體內(nèi)TLR5的表達證實TLR5是否參與E.coli LF82的致病過程;
　　3.利用TLR5基因敲除小鼠探討TLR5對E.coli

7、 LF82作用的影響及可能機制。通過疾病活動性評價指標(biāo)、組織學(xué)表現(xiàn)、超微結(jié)構(gòu)、結(jié)腸組織MPO活性、糖原染色、天狼星紅染色及血清、組織中炎癥細(xì)胞因子的測定等比較感染了E.coli LF82的野生型小鼠和TLR5基因敲除小鼠對DSS造模的表現(xiàn),探討TLR5在E.coli LF82感染結(jié)腸炎小鼠致病過程中的作用。
　　【結(jié)果】
　　1.E.coli LF82可降低腸上皮細(xì)胞屏障跨上皮電阻TEER,增加腸上皮細(xì)胞屏障對熒光黃大分子的

8、通過率,改變腸上皮細(xì)胞屏障緊密連接蛋白的分布和含量,并且影響腸上皮細(xì)胞屏障TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的分泌;
　　2.通過急性活動相關(guān)性指標(biāo)評價發(fā)現(xiàn)E.coli LF82可加重DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎癥,導(dǎo)致小鼠結(jié)腸超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架的改變,E.coli LF82還可降低DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸粘液分泌能力,導(dǎo)致結(jié)腸組織纖維化程度增加,同時增加小鼠血清和結(jié)腸炎炎癥細(xì)胞因子的釋放,伴隨著磷酸化NF-κB P65、P38的表達上調(diào)以及TLR5 m

9、RNA和蛋白水平的升高;
　　3.相比野生型小鼠,E.coli LF82對DSS誘導(dǎo)TLR5KO小鼠的結(jié)腸炎癥程度加重更明顯,E.coli LF82可進一步增加DSS誘導(dǎo)TLR5KO小鼠結(jié)腸炎炎癥細(xì)胞因子的分泌釋放。經(jīng)E.coli LF82處理后,TLR5KO小鼠結(jié)腸組織磷酸化P38表達升高,但是升高的程度比野生型小鼠要低,而磷酸化NF-κB P65的表達則變化不明顯。
　　【結(jié)論】
　　我們的研究證實E.coli L