油菜內(nèi)生枯草芽孢桿菌BY-2的定殖生態(tài)、抗菌機(jī)制和防治菌核病的研究.pdf

1、真菌病害是農(nóng)作物最主要的減產(chǎn)因子，目前采用的化學(xué)防治等措施存在著防治成本高、效果不理想和環(huán)境污染等問題。利用內(nèi)生細(xì)菌以及枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的小分子抗菌肽防治植物病害可克服環(huán)境因子影響和病原菌的耐藥性，并可獲得較穩(wěn)定的防治效果。 本研究從健康油菜植株組織內(nèi)分離到具有生物防治作用的枯草芽孢桿菌BY-2。在模擬自然環(huán)境的盆栽條件下，接種后10d，BY-2在油菜苗期植株內(nèi)的定殖菌數(shù)達(dá)到10<'3>cfu/g(土壤)以上，至30d菌數(shù)仍保持

2、10<'3>cfu/g以上；該菌還能侵入大豆、玉米、小麥等其它植物組組織內(nèi)。BY-2是植物內(nèi)生菌也是植物根際的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，能夠在油菜根際利用其根的分泌物而大量繁殖，接種后10d菌數(shù)達(dá)10<'9>/g(土壤)以上；在根表的附著菌數(shù)也明顯高于植物根際促生菌(PGPR.)Pseudomonus alcaligenes A9。 BY-2對(duì)油菜菌核病、水稻紋枯病菌、棉花枯萎病等15種農(nóng)作物主要病害的病原均有抑制作用，主要通過破壞真菌菌絲、抑

3、制菌核萌發(fā)、誘導(dǎo)植物抗性以及改良微生態(tài)環(huán)境，對(duì)峙培養(yǎng)的抑菌圈其最大的直徑達(dá)到φ=3.7cm。 BY-2對(duì)營養(yǎng)的要求簡(jiǎn)單，生長繁殖速度快，在LB培養(yǎng)液中，28℃下振蕩(150r/min)培養(yǎng)48h達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，菌數(shù)高達(dá)10<'10>/nat，培養(yǎng)72h時(shí)，抗菌物質(zhì)產(chǎn)量最高。37℃細(xì)菌生長最快，但28℃其抗菌物質(zhì)產(chǎn)量和活性最高。細(xì)菌在pH5-9范圍內(nèi)能正常生長繁殖，pH3環(huán)境能夠存活但生長緩慢，pH6-7有利菌株生長和代謝；通氣量

4、以每容器(250mL)中裝120mL液體振蕩(150r/min)培養(yǎng)最佳。 BY-2產(chǎn)生2種類型的抗真菌物質(zhì)，一種是揮發(fā)性抗菌物質(zhì)，可以抑制真菌生長；另一種是細(xì)胞外分泌型抗菌物質(zhì)。細(xì)胞外分泌型抗菌物質(zhì)為該菌的主要抗菌物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵溶液至酸性收集沉淀，再用甲醇溶解提取得到的抗菌物質(zhì)，對(duì)油菜菌核病的抑菌效果與原發(fā)酵液相同。 采用甲醇二次溶解及Sephadex G25葡聚糖凝膠層析柱分離，可以將胞外分泌型抗菌物質(zhì)純化，純化

5、物經(jīng)高效液相色譜儀(HPLC)測(cè)定，在甲醇：水的流動(dòng)相條件下，1.969min出現(xiàn)峰值19mAU，其它成分極少，僅在9.5min后出現(xiàn)極少混雜物質(zhì)峰。改變HPLC流動(dòng)相為三氟乙酸：甲醇，在甲醇：水的流動(dòng)相條件下1.969min出現(xiàn)的樣品峰分離為6個(gè)峰值，用電離噴霧質(zhì)譜分析，其分子量分別為995Da、1009Da、1023Da、1037Da、1051Da和1087 Da。純化物的氨基酸組成及比例為：天冬氨酸：谷氨酸：纈氨酸：亮氨酸=1:1

6、：1:1.5。根據(jù)純化物的氨基酸組成和分子量等特征進(jìn)行綜合分析，表明該物質(zhì)與脂肽類抗生素(lipopeptide)中的表面活性劑Surfactin相似，但氨基酸的比例與已報(bào)道的有差異，1051Da和1087Da 2個(gè)大分子同系物尚未見報(bào)道。這些脂肽抗生素具有耐高溫、抗紫外線、廣譜的pH有效性、在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性和長時(shí)間保持有效性的特點(diǎn)。研究結(jié)果表明，BY-2以及產(chǎn)生的脂肽抗生素都可以有效防治多種真菌病害。油菜離體葉片上對(duì)菌核病的防治率