枯草芽孢桿菌Tpb55菌株對(duì)黑脛病的防治效果、根際定殖規(guī)律及微生態(tài)效應(yīng).pdf

1、前期從煙草葉面分離的一株具有良好生防性能的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Tpb55。本文首先研究了Tpb55對(duì)煙草黑脛病菌的抑菌效果，在此基礎(chǔ)上將綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入Tpb55體內(nèi)，并成功表達(dá)，測(cè)定了Tpb55-GFP的生物活性和穩(wěn)定性。溫室試驗(yàn)探究了標(biāo)記菌Tpb55-GFP在不同深度和位置、不同pH、不同有機(jī)質(zhì)和不同質(zhì)地類型的土壤中定殖規(guī)律。田間試驗(yàn)測(cè)定了Tpb55對(duì)黑脛病的防控能力，并且采用454高通量技術(shù)分析了

2、Tpb55對(duì)煙草根際微生態(tài)的影響。具體結(jié)論如下：
　　1.平板對(duì)峙培養(yǎng)顯示Tpb55菌株對(duì)煙草黑脛病菌的生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用，可以形成明顯的抑菌圈。在電子掃描顯微鏡下，可以觀察到Tpb55對(duì)煙草黑脛病菌菌絲形態(tài)的產(chǎn)生破壞作用，單個(gè)菌絲體破裂、彎曲，形態(tài)干癟、褶皺，原生質(zhì)泄露，整個(gè)菌絲體生長(zhǎng)雜亂無(wú)序。發(fā)酵液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和乙酸乙酯萃取后，Tpb55發(fā)酵液粗提物的EC50數(shù)值為0.33 mg/mL。
　　2.溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，

3、Tpb55菌株、58％的甲霜靈錳鋅（1:400）和對(duì)照處理后黑脛病病情指數(shù)分別為21.44、19.12和71.60，這說(shuō)明Tpb55菌株具有預(yù)防和控制煙草黑脛病的生防潛力。2013年和2014年的田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，Tpb55菌株處理的病情指數(shù)分別為21.44和14.23，58%的甲霜靈錳鋅的病情指數(shù)分別為19.12和11.71，對(duì)照病情指數(shù)分別為31.55和39.51。雖然Tpb55菌株處理的煙草黑脛病病情指數(shù)高于58%的甲霜靈錳鋅的病

4、情指數(shù)，但是2013年和2014年相應(yīng)的病情指數(shù)差異并不明顯。
　　3.使用水母熒光蛋白基因標(biāo)記Tpb55-GFP菌株。標(biāo)記菌株Tpb55-GFP與原始菌株Tpb55相比，對(duì)煙草黑脛病菌和煙草赤星病菌室內(nèi)抑菌能力基本一致，均可以形成明顯的抑菌圈，二者無(wú)明顯差異。標(biāo)記菌株Tpb55-GFP與原始菌株Tpb55對(duì)煙草黑脛病菌和煙草赤星病菌的抑菌率菌高于60%，以上結(jié)果說(shuō)明Tpb55-GFP可以用于進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。
　　4. T

5、pb55-GFP菌株定殖動(dòng)態(tài)結(jié)果顯示，Tpb55-GFP菌株可以在煙草根際成功定殖，相比于其他不同深度土壤的定殖，Tpb55-GFP在煙草根際具有更強(qiáng)的定殖能力，第30天在根際的定殖密度為3.42?106 cfu/g。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)顯示Tpb55-GFP菌株首先可以在煙草根部形成生物膜，然后會(huì)在煙草細(xì)胞之間和維管束組織間分布。不同pH土壤定殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，Tpb55-GFP菌株在pH為6-7中性偏微酸性的土壤中具有更強(qiáng)的定殖能力。

6、不同有機(jī)質(zhì)定殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，Tpb55-GFP菌株在腐熟花生殼的土壤中定殖能力更強(qiáng)，主要原因是其中含有豐富的其生長(zhǎng)繁殖所需要的有機(jī)小分子物質(zhì)。不同土壤類型定殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，Tpb55-GFP菌株在2:1（黏土:砂）土壤中定殖能力最強(qiáng)，此類型土壤接近自然界壤土的性質(zhì)，既有一定的水分和養(yǎng)分的報(bào)紙能力，又有一定的空氣交換能力。
　　5.454高通量測(cè)序表明，在病情發(fā)展過(guò)程中，對(duì)照和處理間不同的細(xì)菌種類和數(shù)量會(huì)有不同的變化。Chao1、A