LXA4對重度子癇前期外周血中性粒細胞凋亡的影響及其機制的研究.pdf

1、目的：脂氧素(lipoxinA4，LXA4)具有促炎癥消退和抗炎作用，子癇前期患者血管內(nèi)過度炎癥反應(yīng)可引起血管內(nèi)皮損傷，而激活的中性粒細胞在血管內(nèi)皮損傷中有著重要的作用，故中性粒細胞的凋亡極為重要，本實驗就LXA4對重度子癇前期外周血中性粒細胞凋亡的影響及其機制進行了研究。 方法： 1.1中性粒細胞的分離。通過非連續(xù)梯度密度離心分離重度子癇前期患者(24例)和正常妊娠待產(chǎn)孕婦(24例)外周血中性粒細胞，通過臺盼藍排斥實驗

2、計數(shù)并評價細胞存活率。形態(tài)學(xué)觀察中性粒細胞純度達94％～97％。 1.2中性粒細胞的培養(yǎng)。將分離出的中性粒細胞懸浮于含10％(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，按每孔終濃度2×106細胞/mE接種于24孔平底培養(yǎng)板，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后取細胞檢測。每組設(shè)定3個平行孔。 1.3形態(tài)學(xué)分析。收集細胞，經(jīng)4％多聚甲醛固定，DAPI染色，Apotome顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。收集細胞，經(jīng)2.5

3、％(體積分數(shù))戊二醛固定，1％(體積分數(shù))鋨酸后固定，樹脂包埋，超薄切片，鉛鈾雙染色，透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。 1.4凋亡率判斷。用FICT-annexinV＼PI流式細胞法檢測各組細胞凋亡率。 1.5Bax蛋白表達量的檢測。用免疫細胞化學(xué)技術(shù)SP法，以PBS代替一抗，作為空白對照，并設(shè)立陰性對照組。每張細胞涂片于400倍視野下，至少觀察300個細胞，以陽性細胞百分比代表Bax蛋白表達量。 2.1中性粒細胞的分離

4、。通過非連續(xù)梯度密度離心分離重度子癇前期患者(24例)和正常妊娠待產(chǎn)孕婦(24例)外周血中性粒細胞，通過臺盼藍排斥實驗計數(shù)并評價細胞存活率。形態(tài)學(xué)觀察中性粒細胞純度達94％～97％。 2.2中性粒細胞的培養(yǎng)。將分離出的中性粒細胞懸浮于含10％(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，按每孔終濃度2×106細胞/mL接種于24孔平底培養(yǎng)板，子癇前期組分為四組，培養(yǎng)液中分別預(yù)先加入終濃度逐漸升高的LX4A(0nmol/L，1

5、nmol/L，10nmol/L，100nmol/L)；正常妊娠對照組分為兩組，分別預(yù)先加入兩種終濃度的LXA4(0nmol/L，100nmol/IL)。于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后取細胞檢測。每組設(shè)定3個平行孔。 2.3凋亡率判斷。用FICT-annexinV\PI流式細胞法檢測各組細胞凋亡率。 結(jié)果： 1、培養(yǎng)兩組中性粒細胞呈現(xiàn)出凋亡極具特征性的形態(tài)學(xué)改變。 2、在流式細胞儀檢測中，正常妊

6、娠組和重度子癇前期組中性粒細胞凋亡率分別為(65.86±3.61)％和(48.91±3.98)％，具有顯著性差異(t=10.93，P＜0.01)。 3、重度子癇前期組外周血中性粒細胞免疫化學(xué)染色顯示中性粒細胞Bax蛋白表達量與凋亡率呈強正相關(guān)(r=0.886，P＜0.01)。 4、在流式細胞儀檢測中，正常妊娠L(fēng)XA4100nmol/L組凋亡率為(67.89±3.531％，與0nmol/L濃度組凋亡率無顯著性差異(P＞0.

7、05)。重度子癇前期組隨LX4A濃度逐漸升高，凋亡率分別為(55.87±4.53)％、(62.22±2.58)％和(69.00±2.24)％，組內(nèi)比較均有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1、重度子癇前期外周血中性粒細胞凋亡延遲。 2、體外LXA4對正常妊娠外周血中性粒細胞凋亡無影響，對重度子癇前期外周血中性粒細胞的凋亡有促進作用，重度子癇前期組隨脂氧素濃度變化凋亡率逐漸增加。 3.重度子癇前期患者外