LXA4對(duì)重度子癇前期外周血中性粒細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：脂氧素(lipoxinA4，LXA4)具有促炎癥消退和抗炎作用，子癇前期患者血管內(nèi)過(guò)度炎癥反應(yīng)可引起血管內(nèi)皮損傷，而激活的中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)皮損傷中有著重要的作用，故中性粒細(xì)胞的凋亡極為重要，本實(shí)驗(yàn)就LXA4對(duì)重度子癇前期外周血中性粒細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制進(jìn)行了研究。 方法： 1.1中性粒細(xì)胞的分離。通過(guò)非連續(xù)梯度密度離心分離重度子癇前期患者(24例)和正常妊娠待產(chǎn)孕婦(24例)外周血中性粒細(xì)胞，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)

2、計(jì)數(shù)并評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。形態(tài)學(xué)觀察中性粒細(xì)胞純度達(dá)94％～97％。 1.2中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)。將分離出的中性粒細(xì)胞懸浮于含10％(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，按每孔終濃度2×106細(xì)胞/mE接種于24孔平底培養(yǎng)板，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后取細(xì)胞檢測(cè)。每組設(shè)定3個(gè)平行孔。 1.3形態(tài)學(xué)分析。收集細(xì)胞，經(jīng)4％多聚甲醛固定，DAPI染色，Apotome顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。收集細(xì)胞，經(jīng)2.5

3、％(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定，1％(體積分?jǐn)?shù))鋨酸后固定，樹(shù)脂包埋，超薄切片，鉛鈾雙染色，透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。 1.4凋亡率判斷。用FICT-annexinV＼PI流式細(xì)胞法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。 1.5Bax蛋白表達(dá)量的檢測(cè)。用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)SP法，以PBS代替一抗，作為空白對(duì)照，并設(shè)立陰性對(duì)照組。每張細(xì)胞涂片于400倍視野下，至少觀察300個(gè)細(xì)胞，以陽(yáng)性細(xì)胞百分比代表Bax蛋白表達(dá)量。 2.1中性粒細(xì)胞的分離

4、。通過(guò)非連續(xù)梯度密度離心分離重度子癇前期患者(24例)和正常妊娠待產(chǎn)孕婦(24例)外周血中性粒細(xì)胞，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)并評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。形態(tài)學(xué)觀察中性粒細(xì)胞純度達(dá)94％～97％。 2.2中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)。將分離出的中性粒細(xì)胞懸浮于含10％(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，按每孔終濃度2×106細(xì)胞/mL接種于24孔平底培養(yǎng)板，子癇前期組分為四組，培養(yǎng)液中分別預(yù)先加入終濃度逐漸升高的LX4A(0nmol/L，1

5、nmol/L，10nmol/L，100nmol/L)；正常妊娠對(duì)照組分為兩組，分別預(yù)先加入兩種終濃度的LXA4(0nmol/L，100nmol/IL)。于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后取細(xì)胞檢測(cè)。每組設(shè)定3個(gè)平行孔。 2.3凋亡率判斷。用FICT-annexinV\PI流式細(xì)胞法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果： 1、培養(yǎng)兩組中性粒細(xì)胞呈現(xiàn)出凋亡極具特征性的形態(tài)學(xué)改變。 2、在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中，正常妊

6、娠組和重度子癇前期組中性粒細(xì)胞凋亡率分別為(65.86±3.61)％和(48.91±3.98)％，具有顯著性差異(t=10.93，P＜0.01)。 3、重度子癇前期組外周血中性粒細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示中性粒細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量與凋亡率呈強(qiáng)正相關(guān)(r=0.886，P＜0.01)。 4、在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中，正常妊娠L(fēng)XA4100nmol/L組凋亡率為(67.89±3.531％，與0nmol/L濃度組凋亡率無(wú)顯著性差異(P＞0.

7、05)。重度子癇前期組隨LX4A濃度逐漸升高，凋亡率分別為(55.87±4.53)％、(62.22±2.58)％和(69.00±2.24)％，組內(nèi)比較均有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1、重度子癇前期外周血中性粒細(xì)胞凋亡延遲。 2、體外LXA4對(duì)正常妊娠外周血中性粒細(xì)胞凋亡無(wú)影響，對(duì)重度子癇前期外周血中性粒細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用，重度子癇前期組隨脂氧素濃度變化凋亡率逐漸增加。 3.重度子癇前期患者外