長沙地區(qū)臨床分享金黃色葡萄球菌的耐藥特征及femB基因的克隆和原核表達.pdf

1、目的：⑴了解長沙地區(qū)臨床分離金黃色葡萄球菌(以下簡稱金葡菌)對常用抗菌藥物的耐藥現(xiàn)狀，探討金黃色葡萄球菌對甲氧西林和萬古霉素的耐藥水平。⑵構(gòu)建金葡菌甲氧西林耐藥輔助基因femB的原核表達載體并在大腸桿菌中表達，為進一步研究金葡菌對甲氧西林的耐藥機制奠定基礎。
　　 方法：①收集長沙地區(qū)11家醫(yī)院2009年11月-2010年11月臨床分離的非重復金葡菌279株，應用vitek-2全自動微生物分析系統(tǒng)進行鑒定，K-B法檢測金葡菌對2

2、4種藥物的敏感性，產(chǎn)色頭孢菌素試驗檢測β-內(nèi)酰胺酶以及D試驗檢測誘導型克林霉素耐藥。②應用頭孢西丁和苯唑西林紙片擴散法篩查耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)；瓊脂稀釋法檢測頭孢西丁，苯唑西林和萬古霉素的最低抑菌濃度(MIC)。(3)提取金葡菌基因組DNA，并以此為模板進行femB基因的PCR擴增，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-femB，并將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌BL21中進行表達。采用SDS-PAGE及Western blot分析對表達蛋白

3、進行驗證。
　　 結(jié)果：⑴279株分離的金葡菌對24種藥物的耐藥分析顯示，敏感率>50％的藥物為9種，敏感率最高的為萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺，均為100％，其次為呋喃妥因(97.1％)、氯霉素(93.5％)和復方新諾明(87.1％)。耐藥率>50％的抗菌藥物有11種，其中以青霉素G和氨芐西林的耐藥率最高，均為97.1％。MRSA的分離率為54.5％，除萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺、呋喃妥因均高度敏感外，MRSA對常用的16種

4、抗生素的耐藥率均顯著高于MSSA。⑵279株金黃葡菌中，β-內(nèi)酰胺酶陽性250株(89.6％)，紅霉素耐藥而克林霉素敏感、中介的30株菌中，D試驗陽性22株(73.3％)。⑶苯唑西林(OXA)和頭孢西丁(FOX)MIC范圍分別為0.125μg/ml～>256μg/ml和2μg/ml～>256μg/ml，苯唑西林的MIC50和MIC90分別為128μg/ml和256μg/ml，頭孢西丁的MIC50和MIC90分別為64μg/ml和256μ

5、g/ml。萬古霉素MIC范圍為1～2μg/ml，MIC50和MIC90均為2μg/ml。(4)經(jīng)PCR，雙酶切以及測序驗證，成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-femB；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導后，SDS-PAGE和Western blot分析證實表達出49KDa目的蛋白。
　　 結(jié)論：①長沙地區(qū)臨床分離的金葡菌β-內(nèi)酰胺酶陽性率，克林霉素誘導型耐藥率均較高，且呈多重耐藥特征。②長沙地區(qū)臨床分離的金葡菌不僅