金黃色葡萄球菌氨基糖苷類、喹諾酮耐藥基因的研究.pdf

1、目的：
　　金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(SA)]是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎及敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌是院內(nèi)感染的常見細菌之一，許多國家都設(shè)有專門機構(gòu)，應(yīng)對金葡菌的院內(nèi)感染問題。隨著內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛應(yīng)用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)隨之增加，且引起的感染和病死率有逐年增加的趨勢。MRSA可通過接觸途徑進行傳播，即易感人群從攜帶者或感染者

2、身上獲得 MRSA，導(dǎo)致傳播流行。腺苷酰轉(zhuǎn)移酶是一種跨膜多重藥物外排蛋白，介導(dǎo)了葡萄球菌對氨基糖苷類藥物(主要是親水性氨基糖苷類藥物)及多種結(jié)構(gòu)上近似甚至無關(guān)的藥物耐藥。該菌對多種廣譜抗菌藥物耐藥，給臨床治療帶來很大困難。因此，對其耐藥機制、耐藥基因的傳播與轉(zhuǎn)移的研究具重要的臨床意義。
　　本研究首次對臨床分離SA氨基糖苷類耐藥基因adenylyltransferase gene、氟喹諾酮耐藥基因NorA進行克隆、測序、表達及初步

3、功能研究，為進行Adenylyltransfe rase、NorA蛋白高級結(jié)構(gòu)測定的結(jié)晶試驗提供必須材料，同時對耐藥基因的深入功能研究奠定基礎(chǔ)，為從分子水平開展醫(yī)院SA耐藥株感染的控制和監(jiān)測提供依據(jù)。
　　方法：
　　取SA臨床分離株復(fù)蘇、鑒定。采用離心柱型DNA抽提純化試劑盒提取SA染色體DNA，根據(jù)Genbank公布的SA基因序列設(shè)計特異性引物，以染色體DNA為模板，通過 PCR技術(shù)擴增 adenylyltransfer

4、ase、NorA全基因，PCR產(chǎn)物純化后與pGEX-4t-1載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α，挑取經(jīng)氨芐篩選的陽性菌落提取質(zhì)粒并經(jīng)雙酶切及測序鑒定。轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21，經(jīng)雙酶切鑒定后以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組菌表達，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及免疫印跡法（Western blot）分析表達結(jié)果；并對pGEX-4T-1-adenylyltransfer

5、ase/BL21重組株進行氨基糖苷類類藥敏實驗。另收集臨床分離的22株金黃色葡萄球菌，采用PCR法檢測adenylyltransferase、NorA基因的攜帶率。
　　結(jié)果：
　　復(fù)蘇的細菌經(jīng)再鑒定確定為SA，以SA染色體DNA為模板，PCR擴增出兩個大小分別約783bp、1167bp左右的片段并將其成功克隆入T載體。序列比對分析顯示adenylyltransferase開放閱讀框長783bp，編碼29.9kDa蛋白；NO

6、RA開放閱讀框長1167bp，編碼43.9kDa蛋白。成功構(gòu)建高效表達載體pGEX-4T-1-adenylyltransferase/NORA，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)分別獲得分子量約55kDa、69kDa的融合表達蛋白，與預(yù)期分子量相符。重組體大腸桿菌藥敏結(jié)果顯示，pGEX-4T-1-NORA/BL21的MIC與pGEX-4T-1/BL21相比僅CIP有2級濃度差異，其余結(jié)果一樣。22株金黃色葡萄球菌中檢出腺苷酰轉(zhuǎn)移酶耐藥基因9株，檢出率為40

7、％； NORA基因12株，檢出率為45%。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了金黃色葡萄球菌氨基糖苷類耐藥基因adenylyltransferase、耐氟喹諾酮耐藥基因NorA的T載體及高效原核表達載體pGEX-4T-1-adenylyltransferase/NorA/并獲得2個重組蛋白的大量表達；重組體大腸桿菌藥敏結(jié)果顯示，pGEX-4T-1-NORA/BL21的MIC與pGEX-4T-1/BL21相比僅CIP有2級濃度差異，其