直腸癌放射治療相關的基因表達譜研究及MMP1基因在直腸癌細胞中的功能分析.pdf

1、背景:
　　結直腸癌，又稱大腸癌，是世界上第三大常見的惡性腫瘤。在我國，結直腸癌的發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢。直腸癌是大腸癌中最常見的一類腫瘤，約占60％左右。惡性腫瘤的一個最主要生物學特征就是轉移，就是癌細胞從原發(fā)病灶遷移到其它部位形成轉移灶，并維持復發(fā)腫瘤的生長。腫瘤一旦發(fā)生轉移，其預后將極差。大多數癌癥患者并非死于原發(fā)性癌而是死于轉移性癌。因此，如何預防直腸癌轉移是直腸癌治療成敗的關鍵。盡管外科手術一直以來都是治療直腸癌的

2、主要手段，但術后復發(fā)率高。目前，術前放療已經成為Ⅱ/Ⅲ期直腸癌的標準療法。放射治療可以最大限度地將放射線的劑量集中照射到病灶內，殺滅腫瘤細胞，同時使周圍的正常組織和關鍵器官免受或盡可能少受不必要的照射。術前放療可以使腫瘤降期、降體積，甚至達到病理學上的完全消失，從而提高手術的局部根治率，還可以減少術中腫瘤種植機會，減少術后腫瘤的復發(fā)率，進而提高患者的長期生存率。但是術前放療使直腸癌細胞發(fā)生了哪些分子變化尚不清楚。
　　基因芯片技術

3、是一種高通量、快速、全基因組分析技術，是研究基因功能強有力的工具之一，現(xiàn)在已普遍應用于醫(yī)學研究的各個領域。基因表達譜是一種生物體或一種細胞對環(huán)境、遺傳或者生化信號發(fā)生反應時，基因表達被激活或抑制數倍甚至數千倍，形成的特征性的基因表達圖譜。表達譜基因芯片可用來檢測基因的表達水平，通過比較不同條件下基因表達的差異情況，可分析疾病形成的基因水平原理、研究基因功能以及與疾病相關的通路，具有準確和簡便兩大優(yōu)點?；蛐酒臄祿治鐾ǔ６夹枰欢ǖ牧?/p>

4、程處理，也就是生物信息學分析。生物信息學是一門整合了統(tǒng)計學、信息學和計算機學等多種技術的交叉學科。該技術利用現(xiàn)有的分析工具和公共數據庫，先對生物芯片的海量數據進行篩選，再采用序列比對、統(tǒng)計分析、生物聚類、功能或通路分析、可視化作圖等方式，挖掘關鍵生物分子及其潛在機制，從而在分子水平上對疾病進行分析，豐富人們對疾病發(fā)生、治療和預后等方面的認識。隨著各種模式生物基因組測序工作的完成，生物信息學已經進入了功能基因組學時代。功能基因組學利用結構

5、基因組所提供的信息和產物，發(fā)展和應用新的實驗手段，通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使得生物學研究從對單一基因或蛋白質的研究轉向多個基因或蛋白質同時進行系統(tǒng)的研究。目前，利用基因表達譜芯片來分析術前放療對直腸癌分子學方面的影響還很少。
　　目的:
　　(1)通過放療前后直腸癌基因表達譜數據的分析，篩選放療后直腸癌中的差異表達基因(DEG)，并分析它們參與的功能和通路以及相互作用關系，預測調控這些DEG的microR

6、NA和轉錄因子(TF)，構建基因調控網絡，找出放療后直腸癌中發(fā)生顯著變化的基因和關鍵功能通路，從分子層面揭示術前放療治療直腸癌的分子機制。
　　(2)驗證上述預測結果的準確性，并檢測在相關基因沉默前和沉默后，直腸癌細胞增殖能力和轉移能力的變化，以及不同X射線放射劑量對直腸癌細胞增殖能力和轉移能力的影響，為臨床放射治療直腸癌提供實驗依據。
　　研究方法:
　　(1)從GEO公共數據庫里下載直腸癌放療前后的mRNA表達譜數

7、據，利用Bioconductor中的limma軟件包對該數據集中所有樣本進行差異表達分析，篩選出放療后直腸癌細胞中的DEG（差異倍數大于1，并且p值小于0.05），并利用DAVID在線軟件對這些DEG進行GO(Gene Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析（p值小于0.05）;利用STRING在線數據庫分析DEG對應的蛋白質相互作用關系，并用C

8、ytoscape作圖軟件構建蛋白互作網絡;利用UCSC數據庫找出DEG中的TF，確定它們調控的差異表達基因，然后利用Cytoscape作圖軟件來構建它們的調控網絡;最后利用多個miRNA數據庫找出DEG與miRNA的調控關系，利用Cytoscape作圖軟件來構建它們的調控網絡。
　　(2)選取放療后直腸癌細胞中差異表達倍數較大，并且與細胞增殖和轉移功能相關的基因作為實驗驗證的對象，選用高轉移性、惡性程度高的結直腸癌細胞系SW620

9、為研究材料，利用MTT法和Transwell法檢測不同X射線放射劑量對SW620細胞的增殖能力和轉移能力的影響，用RT-PCR實驗驗證不同劑量的X射線輻照對SW620細胞相關基因表達的影響。采用siRNA法沉默相關基因，并用RT-PCR和western blot檢測沉默效果。同樣地，利用MTT法和Transwell法檢測相關基因沉默后SW620細胞的增殖能力和轉移能力。
　　結果:
　　(1)通過基因表達譜分析，共篩選出60

10、6個在放療后直腸癌中差異表達的基因（表達差異1倍以上，并且p值小于0.05），其中上調基因271個，下調基因335個，其中MMP1的差異表達倍數最大，且p值最小。
　　(2) GO功能富集分析結果顯示，表達上調的差異基因主要顯著富集在鐵轉運、對無機物和金屬離子的應答等功能上，如SLC6A3、SLC30A4、RYR2和NEDD4L等。表達下調的差異基因主要和細胞信號傳遞、細胞增殖以及膠原代謝有關，其中SLC6A4和PDX1等參與了細

11、胞間的信號轉導功能，PTGS2和CDH5等基因參與了細胞的增殖調控，而MMP10、COL1A1、MMP3和MMP1主要和膠原蛋白的代謝過程有關。
　　(3) KEGG通路富集分析結果顯示，表達上調的差異基因主要顯著富集在甾類激素的生物合成、鈣信號通路、雄性激素和雌性激素的新陳代謝、刺激神經組織的配體和受體相互作用以及年輕人的成年型糖尿病這5條通路上，其中HSD382、UGT2A3、SULT1E1和UGT2815這4個基因參與了甾類

12、激素的生物合成通路以及雄性激素和雌性激素的新陳代謝通路，CYSLTR2、CHRM1和HTR6這3個基因主要參與了鈣信號和刺激神經組織的配體和受體相互作用這兩條通路。表達下調的差異基因顯著富集在細胞外基質與受體的相互作用以及補體和凝血級聯(lián)這兩條通路上，其中COL4A2、COL4A1和COL6A3等7個編碼膠原蛋白的基因參與細胞外基質與受體的相互作用這條通路上，SERPINE1、SERPIND1、F7、PLAU和F2R這5個基因主要參與補體

13、和凝血級聯(lián)通路。
　　(4) DEG的蛋白互作網絡分析結果顯示，該網絡共包含241個蛋白的410個相互作用關系對，連接度大于等于10的節(jié)點共有20個。其中COL1A2和COL1A1的連接度都是18，MMP1的連接度是11。
　　(5)通過UCSC數據庫分析，共找出5個是TF的差異表達基因，包含PAX6、PLAU、FOXL1、NKX2-2和FOSL1。在DEG與TF的調控網絡中，共有77個調控關系對，其中，PLAU除了調控MM

14、P1、COL1A1等DEG，還調控NKX2-2和PAX6這兩個轉錄因子。
　　(6)通過7個miRNA數據庫的綜合分析，共篩選出177對miRNA和差異基因的調控關系，包含145個miRNA和40個差異表達基因，如hsa-miR-29e調控COL1A1、COL1A2、COL4A1和COL4A2這4個基因，MMP1被hsa-miR-222調控，MMP3被hsa-miR-204調控。
　　(7)選取MMP1進行實驗驗證。MMP1

15、沉默前，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，SW620細胞中MMP1的mRNA水平在0.1 GY、0.5 GY、1 GY、3 GY和6 GY這5種輻射劑量下，相對于空白對照組(0 GY)都是降低的，并且輻射劑量在0.5 GY內，MMP1的表達量隨著輻射劑量的增加大幅度降低。
　　(8)通過MTT實驗和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，MMP1沉默前，SW620細胞的增殖能力和轉移能力明顯高于沉默后的（p值小于0.5），并且在輻射劑量6 GY內，S

16、W620細胞的增殖能力和轉移能力隨著輻射劑量的增加逐漸下降。
　　結論:
　　(1)放射治療使直腸癌中一些參與金屬離子應答的基因（如SLC6A3、SLC30A4、RYR2和NEDD4L）、參與鈣離子信號通路與刺激神經組織的配體和受體相互作用通路的基因（如CYSLTR2和CHRM1）、與細胞增殖調控和補體凝血級聯(lián)有關的基因（如PLAU、FOSL1和SERPINE1）、參與膠原代謝的基因（如MMP1和MMP3）以及一些參與細胞外

17、基質與受體的相互作用通路的基因（如COL1A2、COL1A1和COL4A1等）發(fā)生了明顯的表達量變化，這些基因對放療產生了顯著的應答反應。
　　(2)對差異表達基因具有調控作用的一些miRNAs(如hsa-miR-29c、hsa-miR-224、hsa-miR-204和hsa-miR-222)，以及一些轉錄因子（如PLAU和FOSL1等），可能在直腸癌的放療過程中具有重要的調控作用。
　　(3)不同劑量的X射線輻射能使SW6