NgR和NEP1-35結(jié)合小肽的設(shè)計篩選及其促中樞神經(jīng)再生研究.pdf

1、成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)損傷后難以再生，其結(jié)果就是某些功能的永久性喪失。而周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheralnervoussystem，PNS)損傷后可以再生，并且在功能上也能得到較好的恢復(fù)。但是在受損的CNS部位移植胚胎周圍神經(jīng)組織等，卻能觀察到明顯的再生現(xiàn)象，這提示CNS并非缺乏再生能力，而是損傷后的局部微環(huán)境中存在對再生不利的因素。目前已知，在CNS髓鞘中存在多種突起再生抑制性分

2、子，如Nogo、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelinassociatedglycoprotein，MAG)，少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)糖蛋白(oligodendrocytemyelinassociatedglycoprotein，OMgp)等。為克服髓鞘抑制分子的作用，研究者們嘗試了多種不同的方法，如，使用抗Nogo-A抗體IN-1，敲除Nogo基因和使用Nogo分子拮抗劑等，但是都沒有取得非常令人滿意的效果。近年來的研究發(fā)現(xiàn)Nogo有三種亞型，分別為N

3、ogo-A、B和C，它們的C-末端高度同源，包括兩個跨膜域和一個短的胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Nogo-66)。而在CNS中發(fā)揮抑制作用的亞型為Nogo-A，根據(jù)其發(fā)揮功能的途徑可以分為amino-Nogo和Nogo-66兩個部分。有趣的是OMgp、MAG和Nogo-A雖然在序列上沒有相似性，但是卻可以通過同一個受體NgR來傳遞信號，這也許是它們在空間結(jié)構(gòu)上的相似性造成的結(jié)果。NgR沒有胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，只能通過共受體向下傳遞信號，RhoA是這條信息傳導(dǎo)通

4、路上的重要分子，直接或間接增強(qiáng)RhoA的表達(dá)可以抑制神經(jīng)元軸突的生長。同時有研究顯示，Nogo-66可能具有NgR識別域和NgR結(jié)合域，來自Nogo-66序列的小分子可以競爭性結(jié)合NgR，從而阻止Nogo-66與NgR的結(jié)合，克服髓鞘造成的抑制。Nogo是髓鞘抑制分子中被研究得較早和較為深入的一個，具有一定的代表性，但是，對于Nogo-66與NgR識別和激活的具體位點目前還沒有報道。如果能夠同時從Nogo-66和NgR兩方面著手，阻止二

5、者的識別，那么來自Nogo-66的抑制信號將從此中斷，不再向下傳遞，使中樞神經(jīng)元不會受到Nogo-66的影響，為再生創(chuàng)造有利的微環(huán)境。 在本研究中，根據(jù)Nogo-66中NgR結(jié)合關(guān)鍵序列合成了兩條含有10個氨基酸殘基的小肽，肽Ⅱ和肽Ⅲ，并運用神經(jīng)元原代培養(yǎng)、免疫組織(細(xì)胞)化學(xué)、RT-PCR等方法，研究了肽Ⅱ和肽Ⅲ對小腦顆粒細(xì)胞(cerebellumgranulecell，CGC)突起生長的作用以及它們對CGC中RhoA表達(dá)的影

6、響，旨在發(fā)現(xiàn)小肽是否對Nogo-66有競爭性拮抗作用，并且這種拮抗是否可以通過RhoA這個重要的信號分子反映出來；另一方面，通過分析Nogo-66與NgR的結(jié)合特點，合成一條含有35個氨基酸殘基的肽，肽Ⅰ(NEPl-35，Nogoextracellularpeptide1-35)，其序列代表Nogo-66與NgR結(jié)合的氨基酸序列。以該35肽為靶分子，通過噬菌體隨機(jī)肽庫篩選和ELISA及微淘選的鑒定得到陽性克隆，篩選出能以高親和力與Nog

7、o-66結(jié)合的序列，測序后人工合成高純度的肽Ⅳ，研究其對體外培養(yǎng)CGC突起生長的作用以及對RhoA表達(dá)的影響，間接了解肽Ⅳ競爭性結(jié)合Nogo-66后，Nogo-66與NgR的結(jié)合是否受到抑制，能否促進(jìn)中樞神經(jīng)軸突的生長；同時，還建立了大鼠脊髓損傷模型，研究了大鼠脊髓損傷后使用肽Ⅱ和肽Ⅳ對神經(jīng)纖維存活和大鼠后肢功能恢復(fù)的作用，初步探討在體情況下肽Ⅱ和肽Ⅳ對脊髓再生的影響。 主要結(jié)果： 1.通過分析Nogo-66和NgR的序

8、列信息，首先，合成一條35肽，其序列代表Nogo-66與NgR結(jié)合的氨基酸序列，為肽I(NEP1-35)。同時，合成可能與NgR緊密結(jié)合，但不啟動抑制再生信號的肽Ⅱ和肽Ⅲ：肽Ⅰ(NH2-SFRIYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISEEL-COOH)，MW=4011.11，純度＞95％；肽Ⅱ(NH2-SFRIYKGVIQ-COOH)，MW=1210.21，純度＞90％；肽Ⅲ(NH2-VAISEELVQK-COOH)，M

9、W=1114.89，純度＞90％，以DMSO溶解后低溫保存。 2.同時提取坐骨神經(jīng)、肝組織和CNS白質(zhì)膜蛋白包被培養(yǎng)蓋片，與前二者相比，CNS白質(zhì)膜蛋白可以抑制CGC突起的生長，抑制的程度與包被蛋白的濃度相關(guān)，可以作為抑制性基質(zhì)用于CGC的體外培養(yǎng)模型；二甲基亞砜(DMSO)作為CGC培養(yǎng)添加成分，低濃度時不會給CGC突起生長帶來顯著影響。 3.肽Ⅱ可以部分改善CGC突起在包被蓋片上所受到的生長抑制，與對照相比有顯著差異

10、，同時CGC中RhoA的mRNA表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)下調(diào)；肽Ⅲ的作用不明顯。 4.以NEP1-35為靶分子篩選噬菌體隨機(jī)十二肽庫和七肽庫，所得序列雖無一致性，但所得十二肽較為保守的結(jié)構(gòu)為“RRXXXRRXXRXI”(X為非特異性氨基酸)，環(huán)七肽中“TPHRLAA”出現(xiàn)頻率略高。選擇陽性最強(qiáng)克隆中的插入肽，進(jìn)行人工合成，最后獲得高純度的肽Ⅳ(Biotin-NH2-RQTLSHQMRRP-COOH)，MW=1797.7，純度＞90％；因為可

11、能的空間結(jié)構(gòu)問題肽Ⅴ(Biotin-NH2-CTPHRLC-COOH)合成失敗。 5.肽Ⅳ可在一定程度上促進(jìn)CGC突起在包被蓋片上的的生長，與對照相比有顯著差異，但是促進(jìn)的幅度遜于肽Ⅱ；肽Ⅳ作用下CGC中RhoA的mRNA表達(dá)下調(diào)顯著。 6.同時應(yīng)用肽Ⅱ和肽Ⅳ，可進(jìn)一步促進(jìn)包被蓋片上CGC突起生長，同時使CGC中RhoA的mRNA表達(dá)下調(diào)。 7.在大鼠脊髓半橫斷損傷模型中，肽Ⅱ和肽Ⅳ組動物損傷位點后神經(jīng)纖維的密度

12、高于對照組，GFAP有活化的趨勢，同時可以觀察到實驗組大鼠BBB評分高于對照組大鼠，后肢功能恢復(fù)更快。 主要結(jié)論： 本研究證實了CNS白質(zhì)膜蛋白對神經(jīng)元突起生長的抑制作用，并且隨著蛋白濃度的增加抑制作用更加明顯；在突起生長受抑制的同時，神經(jīng)元內(nèi)RhoA的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，說明RhoA參與了神經(jīng)元軸突的生長調(diào)節(jié)過程。 一方面，根據(jù)Nogo-66序列合成的肽Ⅱ可以促進(jìn)CGC突起在CNS白質(zhì)膜蛋白包被蓋片上的生長，

13、同時RhoA的mRNA的表達(dá)下調(diào)，Nogo-66源性的肽Ⅱ確實干擾了NgR的信號傳遞，通過競爭性結(jié)合NgR的拮抗作用抑制Nogo-66與NgR的結(jié)合，從而中斷Nogo-66向下傳遞抑制信號激活RhoA。 同時，通過噬菌體肽庫篩選獲得的能夠以較高親和力結(jié)合NEP1-35的肽Ⅳ同樣可以部分克服CNS白質(zhì)膜蛋白對CGC突起生長的抑制，同時降低CGC內(nèi)RhoA的mRNA的表達(dá)，同樣是通過干擾NgR的信號傳遞來促進(jìn)突起生長，不過與肽Ⅱ的不

14、同在于肽Ⅳ是通過競爭性結(jié)合Nogo-66上的NgR識別域來阻止Nogo-66與NgR的結(jié)合，即肽Ⅱ和肽Ⅳ分別從配體與受體兩個方面著手，阻止Nogo-66和NgR的結(jié)合，降低RhoA的表達(dá)，封閉抑制信號的傳遞，從而達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)元突起生長的目的。 另一方面，建立大鼠脊髓半橫斷損傷模型，把肽Ⅱ和肽Ⅳ運用到大鼠的損傷部位，使大鼠的后肢功能恢復(fù)加快，可能通過減少受損突起的回縮，維持受損部位以下神經(jīng)的營養(yǎng)，從而為功能恢復(fù)創(chuàng)造良好的微環(huán)境。