神經再生室串聯(lián)結合神經放大作用修復長段神經缺損的研究.pdf

1、目的
　　神經損傷往往伴隨著長段的神經缺損，自體神經移植已確定為治療神經缺損的金標準，但是自體神經移植存在供體取材不方便、移植物來源有限、造成副損傷及可能發(fā)生痛性神經瘤等缺點。神經再生室串聯(lián)為我們提供了一種修復周圍神經長段缺損的新方法，將神經的長段缺損轉變?yōu)閮蓚€短段缺損。神經損傷后的神經纖維再生過程中存在著神經纖維放大效應，神經纖維的再生過程中近端的單個軸突可以長出多根新生軸芽。本文研究神經再生室串聯(lián)結合神經放大作用修復長段神經缺

2、損。觀察神經缺損修復程度，探討一種新的長段神經缺損的治療方法。
　　方法
　　1.神經再生室的制備、體外降解率及細胞毒性檢測:PLGA聚合物(85∶15)10％的溶液;以0.1gPLGA:2000UCNTF:0.01gBSA的比例充分攪拌混勻，注模成型后真空干燥48h，消毒后密封保存以備用。將再生室裁成等質量小塊，乙醇浸泡消毒30分鐘后，再置于紫外臭氧中殺菌3小時。將消毒后的材料分別放入模擬體液(SBF)中，置于37℃恒溫箱

3、中。為確保模擬體液自身活性，支架材料每2d換液。分別于1，4，10，21，35，49天取出，干燥后進行質量檢測。取再生室材料放入培養(yǎng)皿中，超凈臺內紫外殺菌照射，雙面各照射2h，培養(yǎng)基浸泡過夜備用。將材料分別放入對應孔板中。接種內皮祖細胞(EPC)，每孔接種1×104個，進行培養(yǎng)。分別在1，3，5，7d四個時間點，移除孔板中培養(yǎng)基，加入無血清的L-DMEM培養(yǎng)基及20μlPBS溶液，孵育1h后，使用酶標儀在450nm波長下測定其吸光度值(

4、OD值)。
　　2.動物模型建立及一般觀察:選取45只日本大耳白兔，雌雄不限，體重在1.5～2.0kg之間，隨機分為3組（A、B、C組），每組15只。麻醉后，無菌條件下以梨狀肌下緣為起點向遠端制造坐骨神經缺損，A、B兩組均制造10mm神經缺損。A組從已缺損的神經遠端切取6mm長神經片段，置于兩個8mm長的再生室之間。B組沿神經遠端切取兩段6mm神經片段，并聯(lián)后兩端各鏈接兩個10mm長的再生室。C組切斷10mm神經片段后翻轉180°

5、神經外膜吻合。術后動物常規(guī)飼養(yǎng)12周。分別于4、8、12周行坐骨神經功能指數(shù)評價。
　　3.檢測神經修復情況:(1)行為學觀察:手術后12周內，定期觀察步態(tài)，傷口情況及足部變化，有無潰瘍形成，并記錄左后肢肌肉萎縮情況。手術后12周，切取標本前觀察導管外形變化、降解情況，神經導管與神經周圍組織的關系、瘢痕形成以及再生神經的連續(xù)性、外觀、直徑大小，有無神經瘤形成等。(2)復合神經動作電位:雙極不銹鋼電針，直徑0.2mm。每格的掃描速度

6、為2.5ms，波幅為5mV，并以0.1ms的方波刺激，刺激頻率1Hz，濾波范圍為10-1000Hz。室溫保持在26℃。游離坐骨神經兩端，刺激電極與記錄電極分別放在游離兩端的坐骨神經下面，地線針插入神經中部下面的組織內，刺激電極與記錄電極均不得接觸附近的肌肉和筋膜組織。(3)再生有髓神經纖維計數(shù):各組分別切取神經近端、神經片段、神經遠端各約3mm，2.5％戊二醛及1％鋨酸中雙重固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片(0.5μm)，甲苯胺藍

7、染色，光鏡下行有髓神經纖維計數(shù)并測量新生軸突直徑和髓鞘厚度。(4)電子顯微鏡觀察神經超微結構:上述方法組織固定、脫水、包埋、切片，然后用3％醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察和攝片。
　　結果
　　1.制得外徑為3mm、內徑2mm、管壁厚度1mm、長度分別為7mm和10mm、管壁微孔孔徑70～80μm、孔隙率約為75％的神經再生室。在降解初期，支架材料質量損失緩慢，從第10天至49天，降解速率開始加快，失重率也增加，第

8、49天測得降解率約為35％。材料細胞毒性研究顯示EPC生長狀況良好，在1d、3d為1級，5d、7d后降為0級。
　　2.術后動物全部存活，各組動物術側足趾屈曲，拖行，膝關節(jié)屈曲障礙;均未出現(xiàn)明顯的全身排斥反應或炎癥反應癥狀;僅1例出現(xiàn)足部潰瘍，并出現(xiàn)實驗動物自噬其下肢現(xiàn)象。坐骨神經功能指數(shù)比較，直至術后12周B組較另兩組有顯著差異，明顯優(yōu)于A、C兩組。
　　3.術后12周，可見再生室均已降解，個別可見少量材料殘留，損傷神經已

9、形成連接，B組可見一明顯的紡錘型位于損傷神經之間;A、C兩組可見較為明顯的神經瘤形成。三組均可以出現(xiàn)復合神經動作電位，可見放大組動作電位峰值最大，傳導速度較快，且潛伏期較其余兩組明顯縮短。光鏡下，B組可見再生神經纖維呈密集集束狀分布，每一神經束內含有大量密集的粗大有髓神經纖維;纖維之間間隙小，神經纖維髓鞘化明顯。纖維直徑和髓鞘厚度明顯大于另兩組。電鏡可見B組神經束膜結構完整，神經纖維數(shù)量多，結構清晰，排列密集，有髓神經纖維髓鞘鞘層多且均

10、勻一致，雪旺細胞數(shù)量多，為三組中結構最好的。
　　結論
　　本實驗以神經小間隙橋接和神經放大作用為理論基礎，在達到神經放大后，新生的軸芽互相競爭通過生長空間較小的損傷遠端，以達到較高的有髓神經纖維通過率，且能夠使通過損傷遠端的神經纖維較為強壯，為臨床提供一種新的長段神經缺損的修復方法，既能夠避免神經移植所造成的其他功能區(qū)的副損傷，又能夠得到較神經移植更好的修復效果。我們認為在術后12周，神經再生室串聯(lián)結合神經放大作用修復長段