家蠶微孢子蟲侵染相關(guān)表面蛋白SP84的分離、純化及鑒定.pdf

1、微孢子蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原生動(dòng)物,能感染從原生動(dòng)物到哺乳動(dòng)物,包括昆蟲、魚類和人類在內(nèi)的幾乎所有的動(dòng)物,同時(shí)又是很有前途的生防制劑。微孢子蟲以孢子發(fā)芽的方式侵染宿主細(xì)胞,孢子發(fā)芽是侵染的先決條件,微孢子蟲表面蛋白又與孢子發(fā)芽以及侵染有關(guān)。因此,對(duì)微孢子蟲侵染相關(guān)表面蛋白的研究,對(duì)微孢子蟲防治和利用具有重要的意義。本論文基于目前對(duì)微孢子蟲表面蛋白和有關(guān)病原微生物侵染宿主細(xì)胞的機(jī)制等方面的研究成果,通過制備特異識(shí)別家蠶微孢子蟲(Nos

2、ema bombycis,Nb)表面蛋白的單克隆抗體(monoclonal antibody,Mab),研究了單抗對(duì)Nb孢子體外發(fā)芽以及入侵家蠶細(xì)胞(Bombyx mori cell,BmN)的影響,發(fā)現(xiàn)了一種和Nb孢子體外發(fā)芽以及侵染有關(guān)的孢子表面蛋白SP84,并對(duì)其進(jìn)行了分離和鑒定,為解明微孢子蟲的侵染機(jī)制提供了重要依據(jù)。
　　 1.制備了特異識(shí)別Nb孢子表面蛋白的單克隆抗體。 通過Nb孢子的動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、篩選、克隆和

3、腹水制備,成功制備了7株(1A6、3B1、3C1、3C2、3C3、3C4和3F1)特異識(shí)別Nb孢子表面蛋白的單克隆抗體。將制備的7株單克隆抗體分別與成熟Nb孢子、未成熟Nb孢子、成熟內(nèi)網(wǎng)蟲屬樣小孢子(Endoreticulatus-like microsporadium,簡(jiǎn)稱Esp)和未成熟Esp孢子反應(yīng),發(fā)現(xiàn)7株單抗和成熟Nb孢子以及未成熟Nb孢子均發(fā)生反應(yīng),其中單抗1A6還和兩種Esp孢子具有免疫交叉反應(yīng),可利用單抗將Nb孢子和在生

4、產(chǎn)上影響不大的內(nèi)網(wǎng)蟲屬樣小孢子準(zhǔn)確區(qū)分。本研究制備的單克隆抗體效價(jià)較高,特異性較好,既可以用來篩選微孢子蟲侵染相關(guān)表面蛋白,也可有效地用于養(yǎng)蠶生產(chǎn)上的Nb孢子的檢測(cè)。
　　 2.單克隆抗體預(yù)處理Nb孢子可以使孢子的體外發(fā)芽率顯著降低。 單抗預(yù)處理Nb孢子后,用分光光度計(jì)法調(diào)查了孢子在發(fā)芽培養(yǎng)基中的發(fā)芽情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),單抗3C2、1A6及3C4對(duì)Nb孢子體外發(fā)芽均有顯著的抑制作用(p0.05),而其中以3C2效果最為顯著,對(duì)Nb孢

5、子體外發(fā)芽相對(duì)抑制率達(dá)到26.4％,而其他單抗對(duì)Nb孢子的體外發(fā)芽未見有顯著的影響(p0.05)。
　　 3.單克隆抗體可以降低Nb孢子對(duì)BmN細(xì)胞的感染率。 選取對(duì)Nb孢子體外發(fā)芽抑制能力最強(qiáng)的單抗3C2,將其預(yù)處理Nb孢子后,接種BmN細(xì)胞,觀察Nb孢子對(duì)細(xì)胞的侵染情況,結(jié)合DAPI活體熒光染色法對(duì)Nb孢子侵染、增殖的整個(gè)過程進(jìn)行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Nb孢子經(jīng)1mg／mL的單抗3C2預(yù)處理以后,與對(duì)照組相比,受感染BmN細(xì)胞的

6、比率明顯下降。從接種12h后開始觀察,到96h后孢子感染的細(xì)胞破潰,試驗(yàn)組受感染細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組。接種后72 h觀察發(fā)現(xiàn),此時(shí)受感染BmN細(xì)胞比率差別最大,經(jīng)單抗3C2預(yù)處理的試驗(yàn)組,受感染細(xì)胞的百分比僅為9.1％,而對(duì)照組卻達(dá)到了57.7％,兩者差了48.6個(gè)百分點(diǎn)。單抗3C2和Nb孢子以及細(xì)胞的共培養(yǎng)還顯示,3C2對(duì)Nb孢子感染BmN細(xì)胞還具有長(zhǎng)期影響,接種72 h后,預(yù)處理組單抗對(duì)Nb孢子感染BmN細(xì)胞的影響顯著下降,而相對(duì)而

7、言,共培養(yǎng)組直到接種96 h后,仍然對(duì)Nb孢子感染BmN細(xì)胞有顯著的影響。
　　 4.通過SDS-PAGE、固相2D-PAGE技術(shù)以及Western-blotting對(duì)單抗3C2識(shí)別的Nb孢子表面蛋白進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)的分析,并將其純化出來。SDS-PAGE顯示Nb孢子表面蛋白圖譜有11條蛋白帶清晰可見：84 kDa、59 kDa、55 kDa、46 kDa、37 kDa、34 kDa、31 kDa、26 kDa、17 kDa、

8、14 kDa和12 kDa。單抗3C2識(shí)別的蛋白大小約為84 kDa左右。Nb孢子表面蛋白的2D圖譜顯示,上樣蛋白量為120μg時(shí),Nb孢子表面蛋白約有160多個(gè),Nb孢子的主要蛋白以中性偏酸性小分子(18 kDa,pI 5.4～pI 7.2)居多。單抗3C2識(shí)別的抗原蛋白(an 84 kDa surface protein,命名為SP84)分子量約為84 kDa,pI為7.2,從2D膠上看,屬于蛋白豐度較低蛋白。
　　 5.間

9、接免疫熒光反應(yīng)(IFAT)以及免疫膠體金試驗(yàn)顯示SP84定位在Nb孢子表面。 單抗3C2的IFAT檢測(cè)到Nb孢子表面具明亮的翠綠色熒光,孢子經(jīng)SDS處理后和單抗反應(yīng)則檢測(cè)不到熒光。免疫膠體金試驗(yàn)還可以看出抗原分布相對(duì)較為分散,呈彌漫性分布,對(duì)照組則未見有金顆粒結(jié)合于孢子外孢壁。
　　 6.免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)結(jié)果顯示SP84可能和其孢內(nèi)或孢外蛋白P34存在蛋白質(zhì)間相互作用。