HMGB1對腦卒中誘導(dǎo)的腦組織炎癥反應(yīng)和外周免疫抑制的效應(yīng)及機制研究.pdf

1、研究背景:缺血性腦卒中是發(fā)病率和致殘率最高的疾病之一。缺血區(qū)血管可因再通而發(fā)生腦缺血再灌注損傷（CIRI）。CIRI誘導(dǎo)腦組織炎癥反應(yīng)和外周免疫系統(tǒng)抑制（SIID，以淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，功能抑制為主要特征，其誘導(dǎo)感染發(fā)生率增高）雙向效應(yīng)，目前治療手段有限。CIRI后，壞死神經(jīng)元釋放高遷移率蛋白BI(HMGB1)，其是一種細(xì)胞因子樣蛋白，在CIRI病理過程中發(fā)揮重要作用。前人研究表明CIRI后，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及T細(xì)胞等免疫

2、細(xì)胞浸潤于缺血區(qū)，參與腦組織炎癥反應(yīng)。已經(jīng)證實，HMGB1的致炎效應(yīng)，可通過作用于小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞而發(fā)揮和傳遞。HMGB1是否同時作用于浸潤的T細(xì)胞，甚至因T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞有交互作用而通過T細(xì)胞再間接作用于巨噬細(xì)胞，目前還不清楚。不僅如此，CIRI后，HMGB1尚可通過破損的血腦屏障進(jìn)入腦脊液甚至外周血。前人研究報導(dǎo)，大劑量HMGB1可通過作用于樹突狀細(xì)胞(DCs)或者直接作用于T細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫功能抑制，而腦卒中后大量入血的H

3、MGB1，是否與外周淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能改變有關(guān)，是否介導(dǎo)SIID的發(fā)生，目前尚無研究報導(dǎo)。
　　研究目的:擬采用局灶性腦缺血再灌注損傷模型，應(yīng)用HMGB1抑制劑Glycyrrhizin（甘草甜素），觀察CIRI后，HMGB1在缺血腦組織中的定位和表達(dá)情況，腦組織炎癥反應(yīng)情況，以及外周器官中T細(xì)胞數(shù)量改變，同時采用T細(xì)胞缺陷動物，離體和在體觀察T細(xì)胞缺陷，對HMGB1效應(yīng)的影響及二者的相關(guān)性，旨在探討HMGB1在CIRI誘導(dǎo)的腦組織

4、炎癥反應(yīng)和外周免疫抑制中的效應(yīng)及機制，為腦卒中的治療和預(yù)后提供新靶標(biāo)。
　　研究方法:本研究首先采用野生型Sprague Dawley(SD)大鼠及CD57BL/6J小鼠，建立大腦中動脈短暫性阻塞的局灶性腦缺血再灌注損傷模型(MCAO)，于再灌注后12、48及72小時，免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察HMGB1在缺血腦組織、局部神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中的定位、表達(dá)情況。而后，于動物腹腔在MCAO再灌注后即刻及3.5小時各注

5、射一次Glycyrrhizin，TTC染色法觀察大鼠腦梗塞體積，免疫熒光染色法檢測缺血區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤情況，以及流式細(xì)胞儀檢測缺血大腦半球單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其亞型CD4+、CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的數(shù)量，以探討HMGB1對CIRI腦組織炎癥和腦損傷的效應(yīng)及機制。然后，采用野生型SD大鼠及T細(xì)胞缺陷的裸大鼠，在短暫性局灶性腦缺血再灌注損傷(MCAO)及永久性電凝大腦中動脈遠(yuǎn)端的永久性局灶性腦缺血再灌注損傷(d

6、MCAO)兩種模型中，以及CD57BL/6J野生型小鼠及T、B聯(lián)合缺陷的SCID小鼠MCAO模型中，以Glycyrrhizin抑制HMGB1，TTC染色法檢測再灌注72小時后，動物腦梗塞體積，探討T細(xì)胞缺陷對HMGB1腦損傷效應(yīng)的影響;接著，將來源于野生型小鼠的脾細(xì)胞，過繼回輸給SCID小鼠，在有無Glycyrrhizin處理之下，觀察腦梗塞體積變化，反向驗證上述發(fā)現(xiàn);另外，離體將來源于野生型與SCID小鼠的脾細(xì)胞，在刀豆蛋白A(Con

7、A)刺激后，與神經(jīng)元共培養(yǎng)，CCK-8試劑盒檢測HMGB1有無被Glycyrrhizin抑制下，神經(jīng)元的存活率，觀察脾細(xì)胞對神經(jīng)元的殺傷效應(yīng)，進(jìn)一步驗證和支持T細(xì)胞缺陷對HMGB1作用的影響。接下來，采用Western-blot和ELISA分別檢測MCAO后24小時腦脊液，以及MCAO后5、24、48小時血清中HMGB1水平以及Glycyrrhizin的效應(yīng)，同時采用流式細(xì)胞儀，檢測HMGB1有無被Glycyrrhizin抑制下，外周血

8、和脾臟中單個核細(xì)胞總數(shù)，以及單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其亞型CD4+、CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的數(shù)量，以探討外周血高水平釋放的HMGB1，與外周器官淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的相關(guān)性。
　　實驗結(jié)果:1、免疫熒光染色顯示HMGB1早在小鼠腦缺血再灌注損傷(CIRI)后12小時即從神經(jīng)元胞核轉(zhuǎn)移到胞漿，48小時釋放至胞外同時伴NeuN+神經(jīng)元數(shù)量減少;與此同時，CIRI后24小時WB檢測到腦脊液和ELISA檢測到血漿HMGB1高水平表達(dá);

9、2、免疫熒光顯示CIRI后72小時腦缺血核心區(qū)CD68+小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞及MPO+中性粒細(xì)胞浸潤增多，而且浸潤的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞亦表達(dá)HMGB1;3、應(yīng)用HMGB1抑制劑Glycyrrhizin，TTC染色顯示野生型大鼠腦梗塞體積減小，免疫熒光顯示腦損傷核心區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量減少，NeuN+神經(jīng)元數(shù)量增多，HMGB1轉(zhuǎn)位和胞外釋放減輕;4、流式檢測顯示缺血再灌注后腦損傷側(cè)包括T細(xì)胞，CD4+、CD8+T細(xì)

10、胞，NK，NKT及B細(xì)胞淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，而Glycyrrhizin抑制淋巴細(xì)胞及其亞型浸潤于缺血區(qū);5、TTC顯示Glycyrrhizin減小MCAO及dMCAO野生型SD大鼠以及MCAO C57小鼠腦梗塞體積，但在T細(xì)胞缺陷裸大鼠及T、B聯(lián)合缺陷SCID小鼠中，其腦保護作用喪失;但SCID小鼠接受WT小鼠脾細(xì)胞過繼回輸，其增大的腦梗塞體積，又可因Glycyrrhizin抑制HMGB1而減小;離體在WT或SCID小鼠的脾細(xì)胞與神經(jīng)元的

11、共培養(yǎng)體系中，Glycyrrhizin改善WT而非SCID小鼠脾細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡;6、Western-blot顯示大鼠MCAO24小時，腦脊液HMGB1表達(dá)增高;ELISA顯示MCAO后5小時，血清HMGB1水平即升高，24小時達(dá)到高峰，48小時仍持續(xù)高水平表達(dá)，Glycyrrhizin顯著降低腦脊液及血清HMGB1表達(dá)水平;7、流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示與CIRI后缺血腦組織炎癥反應(yīng)加劇以及外周血釋放的HMGB1水平升高相反，MCAO

12、48小時，外周血及脾臟單個核細(xì)胞總數(shù)，T淋巴細(xì)胞，CD4+、 CD8+T細(xì)胞，以及B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，而Glycyrrhizin抑制血清高水平HMGB1釋放的同時，顯著改善淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少。
　　結(jié)論:
　　1.HMGB1主要分布于正常神經(jīng)元細(xì)胞核中，CIRI誘導(dǎo)HMGB1向細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位，并于細(xì)胞死亡后釋放入腦脊液及外周血;
　　2.HMGB1可能通過雙向效應(yīng)，一方面活化浸潤于腦組織的T細(xì)胞，介導(dǎo)缺血再灌注損傷后腦組織