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文檔簡介
1、目的:
構建實驗性自身免疫性心肌炎小鼠模型,觀察HMGB1對心肌組織巨噬細胞浸潤和極化的影響,體外對其分子機制進行初步研究,闡明重要炎癥介質HMGB1在EAM發(fā)生、發(fā)展過程中,對浸潤心肌的Mφ極化的調控機制。
方法:
1.實驗性自身免疫性心肌炎小鼠模型的構建:將豬心肌肌球蛋白制備成抗原肽,多次多點注射于小鼠背部皮下,至21天建模結束,進行心肌組織切片HE染色和病理評分。
2.心肌組織巨噬細胞的浸潤
2、與極化分析:免疫熒光檢測EAM小鼠心肌組織浸潤的F4/80+CD86+巨噬細胞。
3. HMGB1對EAM小鼠心肌組織巨噬細胞浸潤和極化的影響:用HMGB1抑制劑丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate,EP)抑制EAM模型中HMGB1的表達與釋放,進行心肌組織切片HE染色和病理評分,免疫熒光檢測EAM小鼠心肌組織浸潤的F4/80+CD86+巨噬細胞。
4. HMGB1在體外對巨噬細胞的極化作用:通過實時熒光定量 P
3、CR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白印跡(western blot)檢測HMGB1處理后ANA-1巨噬細胞和小鼠原代腹腔巨噬細胞iNOS、Arg-1的mRNA和蛋白水平表達量;酶聯免疫吸附測定方法(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清NO分泌量。
5. HMGB1體外誘導ANA-1巨噬細胞極化的分子機制:HMGB1處理ANA-1巨噬細胞后,western blot檢測不同時間點PI3K和E
4、RK1/2磷酸化水平,并使用ERK1/2抑制劑U0126抑制ERK1/2磷酸化,再給以HMGB1處理,通過qRT-PCR檢測胞內iNOS、Arg-1的mRNA水平表達量。
結果:
1.成功構建實驗性自身免疫性心肌炎小鼠模型。
2. EAM小鼠心肌組織F4/80+CD86+M1型巨噬細胞浸潤顯著多于對照組。
3. qRT-PCR結果證明EP可顯著抑制HMGB1表達,且與未處理組相比有統計學差異(P<
5、0.05)。免疫熒光結果顯示,EAM+EP組浸潤的F4/80+CD86+巨噬細胞顯著少于EAM組。
4. qRT-PCR、Western blot和ELISA結果發(fā)現,HMGB1處理過的ANA-1巨噬細胞和小鼠原代腹腔巨噬細胞中iNOS的表達量增多,NO的產生與分泌增多,而Arg-1的表達減少,即巨噬細胞向促炎的M1型極化。
5. HMGB1作用于ANA-1巨噬細胞后, western blot結果顯示, PI3K和
6、ERK1/2磷酸化水平顯著增高,與對照組相比有統計學意義。且使用U0126抑制ERK1/2磷酸化后再給以HMGB1處理時,與未使用抑制劑組相比,iNOS的mRNA含量明顯降低,而Arg-1 mRNA表達卻增多。
結論:
1.實驗性自身免疫性心肌炎小鼠心肌組織中F4/80+CD86+巨噬細胞浸潤增多,抑制HMGB1表達可顯著減少F4/80+CD86+巨噬細胞浸潤。
2. HMGB1促進巨噬細胞向M1極化可能是
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