VEGFs治療淋巴水腫及誘導基質干細胞向淋巴管內皮細胞分化的研究.pdf

1、淋巴水腫按發(fā)病因素可分為：原發(fā)性和繼發(fā)性二大類，繼發(fā)性淋巴水腫是由絲蟲感染、外傷、手術創(chuàng)傷、大劑量放療等諸多后天因素導致的淋巴回流障礙性疾病，以組織間隙的高蛋白水腫為特征，至今仍是醫(yī)學領域的一個難題。長期以來，國內、外在臨床上治療淋巴水腫的方法主要是繃帶捆扎、按摩、針灸、理療等物理療法或手術等，但這些方法只能起到短期緩解作用，都不能從根本上治愈淋巴水腫。從根本上解決問題的方法只有促進淋巴管的新生，新生的淋巴管才能促進淋巴回流，減輕淋巴水

2、腫。 血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族是特異性作用于脈管內皮細胞的生長因子，其結構、功能相似，基因結構與血小板源性生長因子（PDGF）高度同源，其參于形成鏈間和鏈內二硫鍵的8個半胱氨酸是保守的。該家族包括VEGF-A（即傳統(tǒng)意義上的VEGF）、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E以及胎盤源性生長因子（PIGF）等，他們的生物學效應是由三個表達

3、于特定細胞表面的受體來介導的：VEGFR-1（Flt-1），VEGFR-2（KDR或Flk-1）和VEGFR-3（Flt-4）；傳統(tǒng)理論認為VEGF-A與細胞表面受體VEGFR-1，VEGFR-2結合，特異性促進血管新生，VEGF-C在不同蛋白酶解下與細胞表面受體VEGFR-2或VEGFR-3結合，在不同條件下可促進淋巴管新生或血管新生。 根據(jù)VEGF-C可以選擇性誘導淋巴管增生這一功能，我們不難推測，利用VEGF-C基因治療淋

4、巴管生成缺陷性疾病以及淋巴管阻塞導致的淋巴回流障礙性疾病應該是可行的。目前關于利用VEGF-C選擇性誘導淋巴管增生的功能探討淋巴水腫治療的研究已有相關報道：Marika J等探討了一種人類原發(fā)性淋巴水腫的基因治療模型：通過病毒介導VEGF-C基因的治療發(fā)現(xiàn)VEGF-C可以在模型小鼠皮膚中產(chǎn)生有功能的淋巴管，提示生長因子的基因治療對人類的淋巴水腫治療是可行的。因此我們設計推斷VEGF-C同樣可應用于基因治療淋巴管生成缺陷性疾病如淋巴水腫，

5、而用于基因治療研究的關鍵性物質基礎則是VEGF-C基因的真核表達載體。 因此，自1999年起，本課題組針對VEGF-C在腫瘤淋巴轉移中的生物學功能及其應用方面開始了一系列研究，運用分子生物學技術構建了VEGF-C基因的真核表達載體并發(fā)表了相關的論文，為了獲得VEGF-C對于淋巴管內皮細胞的調節(jié)作用和在淋巴管生成作用中的有關線索，探索應用VEGF-C基因治療某些淋巴管形成缺陷性疾病和抑制腫瘤的淋巴管轉移的新方法，本實驗利用大鼠后肢

6、環(huán)形切除部分皮膚并清掃深部淋巴管和淋巴結構建大鼠繼發(fā)性淋巴水腫模型，并在水腫區(qū)局部皮下注射編碼有VEGF-C基因的裸露質粒（pcDNA3．1/VEGF-C），通過MRI，超聲、HE染色、免疫細胞化學等技術研究pcDNA3．1/VEGF-C是否可以促進淋巴管增生并且從解剖，功能和病理上改善淋巴水腫。 根據(jù)VEGFs家族的特性，近兩年來分別有波蘭，日本等學者分別用VEGF-A， VEGF-C等VEGF家族成員從胚胎干細胞中誘導出脈管

7、母細胞表型的細胞，隨后這些細胞分化并表達淋巴管內皮細胞特異性標記物（Prox-1，LYVE-1），并在基質明膠或者細胞外基質上，可形成管狀結構，為淋巴水腫的基因治療開啟了一條新的思路。 骨髓基質干細胞是一類可進行自我復制和更新的細胞，在不同的理化環(huán)境和細胞因子的誘導下能夠跨胚層向骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、肌肉等多種譜系分化。與胚胎干細胞相比，這種干細胞有許多優(yōu)點：易于從自身取材，無免疫排斥反應之憂，涉及較少倫理問題；體外易于擴增、易

8、分離、以及體外操作簡便，因此，在組織器官缺損性疾病，組織器官退行性疾病，遺傳缺陷性疾病等多方面有重要的應用前景。但是，到目前為止，骨髓基質于細胞在繼發(fā)性淋巴水腫的治療方面，甚至在干細胞向淋巴管內皮細胞誘導方面尚處于起始階段，為了獲取相關線索，探索應用VEGFs家族體外誘導骨髓基質干細胞向淋巴管內皮細胞分化的方法研究，我們利用VEGF-A， VEGF-C和EGF-A/VEGF-C聯(lián)合用藥在內皮細胞條件培養(yǎng)基中誘導骨髓基質干細胞，觀察其向淋

9、巴管內皮細胞分化的可能性，尋找VEGFs基因誘導骨髓基質干細胞向淋巴管內皮細胞分化的方法研究，為骨髓基質干細胞治療繼發(fā)性淋巴水腫提供新思路和實驗依據(jù)。 目的： 1、本課題旨在探討VEGF-C基因真核表達載體對大鼠繼發(fā)性淋巴水腫模型的治療作用及對淋巴管新生的作用， 2、尋找VEGFs基因誘導骨髓基質干細胞向淋巴管內皮細胞分化的方法研究，為骨髓基質干細胞治療繼發(fā)性淋巴水腫提供新的思路和實驗依據(jù)。 研究方法：

10、 1、繼發(fā)性淋巴水腫模型的制作，將VEGF-C真核表達載體pcDNA3．1-VEGF-C注射到模型大鼠手術處的皮下組織，用核磁共振，B超，光鏡以及免疫熒光等方法檢測，觀察VEGF-C基因對繼發(fā)性淋巴水腫的治療作用，及對淋巴管新生的作用。 2、常規(guī)分離，純化，培養(yǎng)并鑒定大鼠骨髓基質干細胞； 3、取三代骨髓基質干細胞分別在VEGF-A，VEGF-C及VEGF-A/VEGF-C及條件培養(yǎng)基中誘導分化，于第10天，用光鏡，

11、免疫熒光，RT-PCR及Western Blot做血管內皮細胞特異性標記物CD3，CD34和淋巴管內皮細胞特異性標記物LYVE-1、Prox-1四種標志物鑒定，觀察干細胞向淋巴管內皮細胞的誘導情況。 4、制備鼠尾膠原凝膠，將骨髓基質干細胞來源的淋巴管內皮細胞種植于預先制備好的膠原凝膠基質表面，觀察干細胞來源的淋巴管內皮細胞形成管狀結構的能力。 結果： 1、成功構建大鼠繼發(fā)性淋巴水腫模型，將VEGF-C真核表達載體

12、pcDNA3．1-VEGF-C注射到模型大鼠手術處的皮下組織，核磁共振，B超，光鏡以及免疫熒光等方法檢測，發(fā)現(xiàn)VEGF-C基因治療組繼發(fā)性淋巴水腫消退較對照組明顯（P<0．05），并在模型鼠患處皮下發(fā)現(xiàn)大量新生淋巴管。 2、貼壁培養(yǎng)法成功培養(yǎng)SD雄性大鼠rMSC，通過流式細胞儀檢測CD29，CD90陽性，CD34，CD45陰性證實；骨髓基質干細胞在條件培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)10天后免疫熒光，PT-PCR及Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)

13、：與對照組相比，VEGF-A，VEGF-C及VEGF-A/VEGF-C組淋巴管內皮細胞標志物LYVE-1及Prox-1均為陽性，且血管內皮細胞標志物CD31，CD34表達為陰性。 3、各組骨髓基質干細胞來源的淋巴管內皮細胞在三維培養(yǎng)中均無明顯的管狀結構形成。 結論： 1、VEGF-C基因對模型大鼠繼發(fā)性淋巴水腫有一定的治療效果，并能促進模型鼠患處皮下組織大量淋巴管新生。 2、VEGF-A，VEGF-C及V