海洋真菌Cochliobolus lunatus中十四元大環(huán)內(nèi)酯及其抗污損和殺菌作用.pdf

1、珊瑚礁低等無脊椎動物在激烈的生存競爭中演化形成了獨特的化學防御機制,這些生物產(chǎn)生的化學防御物質(zhì)是尋找發(fā)現(xiàn)海洋防污劑、殺菌劑及殺蟲劑等的重要資源。本研究組從中國南海珊瑚、海葵、海綿等低等無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了一系列具有抗污損、殺菌、殺蟲、抑藻等活性的化合物。然而受到資源限制,無法獲得大量活性化合物。生態(tài)學研究發(fā)現(xiàn),海洋無脊椎動物中的共附生微生物可能參與了宿主次級代謝產(chǎn)物的生物合成。受此啟發(fā),本研究從海洋共附生真菌中篩選發(fā)現(xiàn)抗污損、殺菌活性化合

2、物,為海洋天然防污劑、農(nóng)業(yè)殺菌劑的研究開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。
　　以2株海洋來源真菌 Cochliobolus lunatus(M351)和 C. lunatus(TA26-46)為研究對象,分離鑒定了14個十四元二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯(resorcylic acid lactones,簡稱 RALs)化合物,其中新化合物7個,新天然產(chǎn)物1個,通過結(jié)構(gòu)修飾獲得30個衍生物。對分離獲得的化合物及其衍生物進行了抗污損、抗農(nóng)業(yè)致病真菌等生物活

3、性研究,獲得抗污損活性化合物14個,初步探討了構(gòu)效關(guān)系;獲得抗農(nóng)業(yè)致病真菌活性化合物2個,并探討了其殺菌作用機制。
　　1.真菌C. lunatus(M351)中十四元大環(huán)內(nèi)酯分離、鑒定及其抗污損活性
　　本研究組前期從一種蕾二歧燈芯柳珊瑚 Dichotella gemmacea中獲得一系列具有顯著抗污損活性的 Briarane型二萜化合物,啟示我們從柳珊瑚共附生真菌中篩選發(fā)現(xiàn)抗污損化合物。本研究從柳珊瑚 D. gemmac

4、ea中分離共附生真菌,在抗藤壺 Balanidae Amphitrite幼蟲附著活性指導下,選擇一株真菌 C. lunatus(M351)進行研究。對該菌進行發(fā)酵培養(yǎng),綜合運用各種分離手段和波譜學技術(shù),分離鑒定了7個十四元大環(huán)內(nèi)酯(1–7)。其中,1–3為新化合物,1和2的結(jié)構(gòu)中含有自然界罕見的丙酮叉片段,3為罕見的鹵代十四元大環(huán)內(nèi)酯?？固賶赜紫x附著活性結(jié)果表明,在無毒濃度下,化合物1、4、5、7具有顯著的抗污損活性,EC50值分別為1

5、.2、5.0、5.3、17.9μg/mL,遠低于美國海軍規(guī)定的潛在天然抗污損化合物 EC50值低于25μg/mL的標準?；钚曰衔?、4、5均具有較高的功效毒性比,LC50/EC50分別>16.7、>20.0、>18.9(當 LC50/EC50>15時,可視為無毒抗污損化合物),因此這些化合物具備發(fā)展成為新型無毒高效天然防污劑的潛力。
　　2.真菌 C. lunatus(TA26-46)中十四元大環(huán)內(nèi)酯分離、鑒定、結(jié)構(gòu)修飾及其抗污

6、損、殺菌作用
　　基于十四元大環(huán)內(nèi)酯獨特的結(jié)構(gòu)特點以及顯著的抗污損活性,本研究試圖對該類化合物進行深入研究。然而,真菌 C. lunatus(M351)代謝不穩(wěn)定,再次發(fā)酵未獲得目標化合物。通過文獻調(diào)研、形態(tài)學比較、分子鑒定,并對發(fā)酵產(chǎn)物進行 HPLC-UV,NMR分析,從本實驗室的海洋真菌庫中獲得了另一株能夠產(chǎn)生十四元大環(huán)內(nèi)酯的真菌 C. lunatus(TA26-46),該菌分離自中國南海?？鸓alythoa haddoni。

7、通過發(fā)酵條件優(yōu)化,確定使用大米固體培養(yǎng)基進行大規(guī)模發(fā)酵。從發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了12個十四元大環(huán)內(nèi)酯(1、4–14),包括4個新化合物(8–10、12)。8–11為非對映異構(gòu)體,區(qū)別在于 C-4′,C-5′構(gòu)型不同,運用 CD激子手性法以及 ECD法確定了這4個化合物的絕對構(gòu)型。化合物12為罕見 C-8′位有羥基取代的十四元大環(huán)內(nèi)酯,從生源合成的角度考慮,確定了 C-4′,C-5′構(gòu)型,C-8′的絕對構(gòu)型由于受到化合物量的限制尚未確定。通

8、過結(jié)構(gòu)修飾獲得30個衍生物。
　　采用抗藤壺幼蟲附著、抗農(nóng)業(yè)致病真菌等活性模型對分離獲得的化合物及其衍生物進行活性篩選。在抗藤壺幼蟲附著活性中,化合物1a、1b、4j、6、6d、6f、8、10、11、13具有顯著的抗污損活性,EC50值分別為15.4、12.5、9.0、1.82、3.85、10.5、17.3、6.67、18.1、22.5μg/mL(EC50<25μg/mL),且 LC50/EC50>15,具備開發(fā)為高效、低毒、環(huán)境

9、友好型天然防污劑的潛力。構(gòu)效關(guān)系分析表明,羥基、順式烯酮片段、丙酮叉片段等為活性基團。在抗農(nóng)業(yè)致病真菌活性測試中,6顯示了強殺菌活性。在對感染致病疫霉菌 Phytophthora infestans的馬鈴薯進行預防性葉面噴灑試驗中,當濃度為200、60和20 ppm時,殺菌率分別為98％、98%和92%,與陽性對照甲霜靈活性相當(98%、98%和98%);在對感染致病疫霉菌 P. infestans的番茄進行灌溉試驗中,當濃度為6 pp

10、m時,殺菌率為86%;更顯著的是,在對感染霜霉病菌 Plasmopara viticola的葡萄進行預防性葉面噴灑試驗中,6的活性強于陽性對照甲霜靈,當濃度為6 ppm時,殺菌率為91%,而甲霜靈對該菌的殺菌率為0。此外,化合物6的殺菌作用機制是一個尚未闡明的新的作用機理。
　　本研究的創(chuàng)新性體現(xiàn)在:從海洋低等無脊椎動物及其共附生微生物的化學防御機制出發(fā),尋找高效、低毒、天然海洋防污劑和農(nóng)業(yè)殺菌劑;從柳珊瑚和海葵共附生真菌中分離獲