創(chuàng)傷性顱腦損傷后腸道上皮細(xì)胞線粒體功能變化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury, TBI）是神經(jīng)外科最常見的疾病，隨著工業(yè)及交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展，其發(fā)病率逐年升高。因?yàn)槠涓咧滤缆屎椭職埪?，TBI一直以來都被臨床醫(yī)生和眾多學(xué)者重視。而事實(shí)上，相當(dāng)一部分TBI患者并非原發(fā)病致死，而是多器官功能障礙（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）致死。許多研究表明，腸道不僅是MODS的靶器官，更是MODS的啟動者。鑒于此，人們越

2、來越重視TBI后腸功能紊亂的情況，對TBI后腸道屏障功能的研究也成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個重要課題和熱點(diǎn)。
　　TBI后常發(fā)生腸功能障礙。腸功能障礙主要表現(xiàn)為胃腸動力下降，腸黏膜營養(yǎng)吸收障礙，黏膜破壞等。已有的研究主要集中在腸黏膜的顯微結(jié)構(gòu)改變，黏膜屏障破壞，黏膜血流變化以及炎癥反應(yīng)等，確切的機(jī)制仍不清楚。為了保證重要器官如心腦的血供，TBI后腸黏膜上皮細(xì)胞常處于缺血或低灌注狀態(tài)。不幸地是，腸黏膜上皮細(xì)胞能量儲備有限，不足以應(yīng)對缺血或

3、低灌注的狀態(tài)。所以，腸黏膜上皮細(xì)胞對缺血缺氧非常敏感。一旦TBI發(fā)生，腸黏膜上皮細(xì)胞將面對強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激。
　　線粒體作為機(jī)體氧化磷酸化和能量供應(yīng)的”重要工廠”，在氧化應(yīng)激中扮演了重要的角色。一方面，線粒體呼吸作用可以產(chǎn)生機(jī)體所需的ATP，同時，呼吸作用也會產(chǎn)生大量反應(yīng)性氧族(reactive oxygen species，ROS)，從而進(jìn)一步發(fā)生氧化損傷。雖然線粒體與能量代謝密切相關(guān)，但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)TBI后腸道黏膜上皮細(xì)胞線粒體

4、功能變化的研究。
　　第一部分兩步法制備高質(zhì)量大鼠小腸上皮細(xì)胞線粒體
　　目的:探討一種兩步制備高質(zhì)量大鼠小腸上皮細(xì)胞線粒體的方法。方法:首先，用膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法制備高質(zhì)量的大鼠小腸上皮細(xì)胞;第二步再參考從培養(yǎng)的組織細(xì)胞中提取線粒體的方法從第一步制備的大鼠小腸上皮細(xì)胞中提取線粒體。BCA蛋白定量試劑盒測定制備的線粒體蛋白濃度;Western-blotting檢測樣品及對照品中Pax-5、β-actin、CoxⅣ的濃度

5、來反映制備的線粒體純度及污染情況;測定制備的線粒體完整性、穩(wěn)定性以及生物活性。結(jié)果:檢測制備的20例大鼠小腸上皮細(xì)胞線粒體樣本，最低濃度為2.2108μg/μl，最高濃度為4.4516μg/μl，平均濃度為3.1932μg/μl;制備的線粒體樣品中Pax-5、β-actin表達(dá)量比較低，CoxⅣ表達(dá)量較高;以細(xì)胞色素C氧化酶為標(biāo)志酶在0～4℃保溫2h，檢測線粒體完整性仍在97％以上;制備的線粒體中細(xì)胞色素C氧化酶能很好的氧化NADH和蘋

6、果酸，且其活性可以被1 mmol/L KCN抑制;制備的線粒體ATP酶含量與對照組（從培養(yǎng)的IEC-6細(xì)胞株制備的線粒體）無明顯差別。結(jié)論:兩步法制備大鼠腸道上皮細(xì)胞線粒體方法簡便，制備的線粒體蛋白濃度和純度較高，胞質(zhì)和細(xì)胞核污染少，線粒體完整性和穩(wěn)定性較好，線粒體活性也保持地較好，適于線粒體功能實(shí)驗(yàn)研究。
　　第二部分創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)后大鼠腸道上皮細(xì)胞線粒體呼吸功能及相關(guān)酶活性的變化
　　目的:觀察創(chuàng)傷性顱腦損傷(

7、TBI)后大鼠腸道上皮細(xì)胞線粒體呼吸功能及相關(guān)酶活性的變化情況。方法:雄性SD大鼠56只，隨機(jī)分為7組（每組8只），包括對照組、腦損傷后6、12、24 h和2、3、7d各1組。采用Feeney自由落體撞擊法制作TBI模型。使用Clark氧電極測定線粒體呼吸功能（呼吸控制率和ADP/O比）;線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ-Ⅳ以及相關(guān)酶（丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶）活性用分光光度計(jì)測定。結(jié)果:與對照組相比，創(chuàng)傷性顱腦損傷后大鼠腸道

8、上皮細(xì)胞線粒體呼吸控制率在傷后6h開始下降，并且一直持續(xù)到傷后7d仍低于對照組(control,5.42±0.46;6 h,5.20±0.18;12 h,4.55±0.35;24 h,3.75±0.22;2 d,4.12±0.53;3 d,3.45±0.41;7d，5.23±0.24; P＜0.01)。磷氧比在傷后12h開始顯著下降，一直持續(xù)到術(shù)后3d(12 h,3.30±0.10;24 h,2.61±0.21;2d,2.95±0.18

9、;3 d,2.76±0.09; P＜0.01)。傷后24h和3d各可以觀察到1個峰值。線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ(6 h:110±10，12 h:115±12，24 h:85±9，2 d:80±15，3 d:65±16; P＜0.01)和復(fù)合物Ⅱ(6 h:105±8，12 h:110±92，24 h:80±10，2 d:76±8，3 d:68±12; P＜0.01)的活性在傷后6h和12h先增高，然后從傷后24 h開始下降，并持續(xù)到傷后3d。

10、與對照組相比，線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ和復(fù)合物Ⅳ傷后變化無明顯差別。此外，與對照組相比，丙酮酸脫氫酶活性在傷后6h開始下降，并且一直持續(xù)到傷后7d仍低于對照組（6 h:90±8，12 h:85±10，24 h:65±12，2 d:60±9，3 d:55±6，7 d:88±11;P＜0.01）。α-酮戊二酸脫氫酶活性變化規(guī)律與丙酮酸脫氫酶類似，但其活性下降是從傷后12h開始的(12 h:90±12，24 h:80±9，2 d:76±15，3

11、d:68±7，7 d:90±13; P＜0.01)。蘋果酸脫氫酶活性傷后無明顯變化。結(jié)論:創(chuàng)傷性顱腦損傷后線粒體呼吸功能和部分相關(guān)酶活性收到抑制，線粒體功能不良可能在創(chuàng)傷性顱腦損傷后腸道功能障礙的發(fā)生中扮演重要角色。
　　第三部分創(chuàng)傷性顱腦損傷后大鼠腸道上皮細(xì)胞線粒體膜電位和通透性轉(zhuǎn)換的改變
　　目的:觀察創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)后大鼠腸道上皮細(xì)胞線粒體膜電位和通透性轉(zhuǎn)換的改變情況。方法:雄性SD大鼠96只，體重220～26

12、0 g，按隨機(jī)數(shù)字法分均為假手術(shù)對照組和TBI組，每組按照術(shù)后3、6、12h和1、3、7d分為6個亞組(n=8):采用Feeney自由落體撞擊法制作TBI模型，假手術(shù)組對照組僅行右側(cè)頂部開窗而無TBI。分別于TBI后3、6、12h和1、3、7d處死各組8只大鼠，分離腸黏膜上皮細(xì)胞，用流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)，成功提取腸道上皮細(xì)胞線粒體后分別測定線粒體膜電位(MMP)和通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)活性。結(jié)果:與假手術(shù)對照組比較，TBI組凋亡指