乳酸菌調(diào)節(jié)小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后腸運動功能和保護(hù)Cajal間質(zhì)細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 胃腸動力障礙(GastrointestinAlmotility disturbances，GMD)是危重癥的常見并發(fā)癥，常伴發(fā)腸道粘膜屏障通透性增高和細(xì)菌易位，是導(dǎo)致創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic braininjury, TBI)等危重患者對腸內(nèi)營養(yǎng)不耐受，發(fā)生返流、嘔吐、腹脹等不良反應(yīng)，引發(fā)吸入性肺炎、嚴(yán)重營養(yǎng)不良、膿毒血癥和多器官功能衰竭等并發(fā)癥的重要原因，因此積極改善TBI后GMD 將有益于降低患者的IC

2、U 住院日，改善預(yù)后。危重癥的GMD常表現(xiàn)為胃竇動力不足、胃排空延遲、遷移型復(fù)合波減少等，其發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)激素調(diào)節(jié)、炎癥介質(zhì)釋放等多種因素相關(guān)。因此，胃腸運動功能調(diào)節(jié)成為關(guān)注的熱點。胃腸道與心臟相似都具有自主節(jié)律性運動，心臟的自主節(jié)律性來源于竇房結(jié)的自發(fā)性電活動，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，胃腸道的自主節(jié)律性運動由CajAl間質(zhì)細(xì)胞(interstitiAlcellsof Cajal，ICC)自發(fā)性電活動——慢波(slow wave)誘導(dǎo)，同時I

3、CC 也是慢波的傳導(dǎo)者和腸神經(jīng)作用的首要靶點，在調(diào)控胃腸運動中具有重要作用。已有研究證實, ICC 網(wǎng)絡(luò)的受損、異常、增生或缺失都會導(dǎo)致胃腸慢波異常，從而引起胃腸動力障礙或疾病。此外，胃腸動力與胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)和平滑肌細(xì)胞密切相關(guān)。
　　 乳酸菌是益生菌的重要組成成分，廣泛存在于人體的皮膚、口腔、胃腸道、泌尿生殖道內(nèi)。有研究證實乳酸菌可抑制腸道炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增生，維護(hù)腸黏膜屏障的完整性，改善腸道菌群紊亂，降低內(nèi)毒素和膿毒

4、血癥的發(fā)生率；近來還發(fā)現(xiàn)其對胃腸動力紊亂具有改善作用，可用于治療急慢性腹瀉、便秘、腹脹、功能性消化不良等。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)乳酸菌可改善腦損傷后胃腸動力障礙，但是機制不明。本課題擬在前期研究基礎(chǔ)上，探討腦損傷后小腸收縮運動和ICC的變化以及乳酸菌對腦損傷后腸收縮運動和ICC的調(diào)節(jié)作用及可能機制，為改善危重癥后的胃腸動力障礙奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：按隨機數(shù)字表法將昆明小鼠分為假傷C組、腸內(nèi)營養(yǎng)EN組、乳酸菌P組。創(chuàng)傷后4h 左右

5、，C、EN組小鼠給予普通腸內(nèi)營養(yǎng)，P組將乳酸菌溶于普通腸內(nèi)營養(yǎng)中喂養(yǎng)。顱腦損傷小鼠攝入熱量：按732.2KJ/kg·d的標(biāo)準(zhǔn)，30～40g的昆明小鼠,每天需要熱量22.0～29.3KJ。普通腸內(nèi)營養(yǎng)使用聚洋全營素((大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所營養(yǎng)科研制)。乳酸菌制劑選用：Probiotics 2000TM (瑞典，Medipham)，其主要成分為：植物乳桿菌(lactobacillus plantarum2362)、干酪乳桿菌(lactob

6、acillus casei ssp paracasei19)、棉子糖明串株菌(leuconostoc raffinolactis 23-77:1)、戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus 16:1)?？偤坎坏陀?011cfu/g。每只小鼠喂養(yǎng)量不低于1x1010cfu/d。在創(chuàng)傷后1d、3d、7d分別收集各組小鼠的末端回腸組織、糞便等進(jìn)行指標(biāo)檢測，通過觀察腦損傷小鼠離體平滑肌收縮運動，小腸ICC 數(shù)量和超微結(jié)構(gòu)，小

7、鼠排便量和體重等的變化，探討腦損傷后腸收縮運動和腸ICC的變化以及乳酸菌對腦損傷后腸ICC的調(diào)節(jié)作用，同時還檢測腸道炎癥因子和c-kit蛋白等含量，進(jìn)一步探討作用可能機制。數(shù)據(jù)均以均數(shù)加標(biāo)準(zhǔn)差(x ˉ±s)表示，統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行單因素方差分析，以P ﹤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.乳酸菌對TBI后小腸收縮運動的影響
　　 (1)收縮模式：假傷組各時相點肌條收縮規(guī)律

8、且整齊，放大5倍后波形為光滑(波谷和波峰為光滑曲線)的正弦波或余弦波；同假傷組比較，TBI后腸內(nèi)營養(yǎng)組1d、3d、7d 肌條收縮模式紊亂不規(guī)律，出現(xiàn)時高時低的波動，甚至波幅消失，且放大5倍后可觀察到波谷和波峰出現(xiàn)尖銳化；乳酸菌組相對假傷組肌條收縮模式有不同程度的紊亂，但相對腸內(nèi)營養(yǎng)組，各時相點運動模式較規(guī)律，波幅明顯增大，放大5倍后波形連續(xù)，多數(shù)波峰和波谷光滑，少數(shù)呈尖銳化。
　　 (2)收縮幅度：與假傷組相比，TBI后腸內(nèi)營養(yǎng)

9、組各時相點平滑肌收縮幅度明顯降低(P<0.01)，而乳酸菌喂養(yǎng)組除1d 明顯降低外(P<0.05)，3d、7d 已與假傷組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；和腸內(nèi)營養(yǎng)組相比，乳酸菌組除1d 無顯著差異外，3d、7d 均顯著高于腸內(nèi)營養(yǎng)組(P<0.01)。
　　 (3)收縮頻率：與假傷組相比，TBI后腸內(nèi)營養(yǎng)組各時相點平滑肌收縮頻率顯著減少(P<0.01或P<0.05)，而乳酸菌組除1d、3d 無顯著差異外，7d 收縮頻率顯著增多(P

10、<0.05)；和腸內(nèi)營養(yǎng)組相比，乳酸菌組1d、3d 無顯著差異，7d組平滑肌收縮頻率顯著高于腸內(nèi)營養(yǎng)組(P<0.01)。
　　 (4)平均張力：與假傷組相比，TBI后腸內(nèi)營養(yǎng)組1d平滑肌收縮平均張力明顯降低(P<0.01)，3d、7d 無顯著差異，而乳酸菌喂養(yǎng)組1d、7d平均張力降低(P<0.01)，3d與假傷組無統(tǒng)計學(xué)差異；和腸內(nèi)營養(yǎng)組相比，乳酸菌組各時相點平滑肌收縮平均張力均無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 2.乳酸菌對TBI后

11、ICC的影響及其可能機制
　　 2.1末端回腸腸肌叢ICC(ICC-MY)數(shù)量及其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的觀察
　　 (1)ICC-MY 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)：激光共聚焦顯微鏡觀察假傷組ICC-MY 其形態(tài)表現(xiàn)為多極性，形成多個分支，彼此交織，形成“魚網(wǎng)狀”緊密細(xì)胞間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。TBI后，腸內(nèi)營養(yǎng)組3d、7d 網(wǎng)絡(luò)明顯變稀薄，分支減少，而乳酸菌組網(wǎng)絡(luò)相對腸內(nèi)營養(yǎng)組變稠密，但仍未達(dá)到假傷組水平。
　　 (2)ICC-MY細(xì)胞數(shù)量：與假傷組相比

12、，TBI后，腸內(nèi)營養(yǎng)組末端回腸ICC-MY細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05 或P<0.01)，乳酸菌組除3d 無統(tǒng)計學(xué)差異外，1d、7d 末端回腸ICC-MY細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01)；與腸內(nèi)營養(yǎng)組相比，乳酸菌組除1d 無顯著差異外，3d、7d細(xì)胞數(shù)量均明顯增多(P<0.05)。
　　 2.2 ICC及其周圍平滑肌組織的超微結(jié)構(gòu)的觀察
　　 假傷組(1d、3d、7d)：ICC細(xì)胞呈紡錘形，有巨大的卵圓形核及向外伸展的

13、長突起，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體、大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，ICC-MY 走行于神經(jīng)細(xì)胞和縱行、環(huán)形平滑肌細(xì)胞之間。ICC與平滑肌細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞之間形成突觸樣連接，也可見ICC、神經(jīng)元細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞之間相互形成縫隙連接；平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)非常豐富，可見密體和密斑等成分，存在線粒體和高爾基復(fù)合體，突起部分主要為細(xì)絲，細(xì)胞外可見完整的基膜；神經(jīng)元細(xì)胞線粒體正常無腫大壞死等。
　　 腸內(nèi)營養(yǎng)組(1d、3d、7d)：可見ICC 胞質(zhì)溶解

14、，胞漿減少，電子密度降低，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少，也可見較多透明小泡，線粒體破壞嚴(yán)重，線粒體固縮變性、髓鞘樣結(jié)構(gòu)形成，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，細(xì)胞膜破損。最顯著的變化是ICC與平滑肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞之間間隙增寬，縫隙連接減少；平滑肌損傷嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹，胞質(zhì)溶解，電子密度降低，出現(xiàn)大量透明小泡，髓鞘樣結(jié)構(gòu)形成；神經(jīng)元核固縮，胞體縮小變形，神經(jīng)元腫脹、變圓，胞漿著色淺而呈蒼白均質(zhì)狀。
　　 乳酸菌組(1d、3d、7d)：ICC細(xì)胞形態(tài)基本正常

15、，可見高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等豐富的細(xì)胞器，線粒體基本正常或輕度腫脹，可見多量透明小泡。ICC細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)異染色質(zhì)，細(xì)胞核核周間隙輕微增寬，細(xì)胞膜有破損；平滑肌細(xì)胞胞漿較豐富，含豐富線粒體，胞漿內(nèi)可見大量的透明小泡；神經(jīng)元纖維之間出現(xiàn)空洞，少數(shù)神經(jīng)元變圓、胞體縮小變形。超微結(jié)構(gòu)改變也可見ICC、神經(jīng)元細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的間隙增寬，縫隙連接減少。ICC細(xì)胞、平滑肌和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)在各時相點較腸內(nèi)營養(yǎng)組均有一定的改善；在傷后7d，可見

16、ICC與平滑肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞之間可見縫隙連接增多。2.3 末端回腸組織勻漿c-kit蛋白的表達(dá)與假傷組相比，腸內(nèi)營養(yǎng)組末端回腸c-kit蛋白條帶明顯變細(xì)變?nèi)酰f明TBI后，小腸c-kit蛋白表達(dá)降低；而乳酸菌組相對腸內(nèi)營養(yǎng)組，條帶變黑變粗，說明乳酸菌處理后，c-kit蛋白表達(dá)增多。
　　 2.4 末端回腸組織勻漿IL-1β含量的檢測
　　 與假傷組相比，TBI后1d、3d、7d，腸內(nèi)營養(yǎng)組末端回腸組織IL-1β含量明顯

17、增高(P<0.01)，乳酸菌組各時相點均無顯著差異；與腸內(nèi)營養(yǎng)組比較，乳酸菌組各時相點IL-1β含量均顯著降低(P<0.01)。
　　 3．整體性指標(biāo)
　　 3.1小鼠排便量
　　 與假傷組相比，TBI后，腸內(nèi)營養(yǎng)組各時相點小鼠大便量均顯著降低(P<0.05 或P<0.01)，乳酸菌組除1d 無顯著差異外，3d、7d小鼠大便量均顯著減少(P<0.01)。與腸內(nèi)營養(yǎng)組相比，乳酸菌組除3d 外，其余時相點小鼠大便量均

18、顯著增多(P<0.01)。
　　 3.2小鼠體重變化
　　 建模前和建模后4h，各組的小鼠體重?zé)o差異(P>0.05)。在術(shù)后1d、3d、7d小鼠體重均有不同程度的降低，但是假傷組小鼠3d后體重下降趨勢開始減緩。與假傷組體重減少值相比，TBI 腸內(nèi)營養(yǎng)組1d后體重減輕更明顯，直到7d后仍無明顯改善(P<0.05或P<0.01)，而乳酸菌組，在1d、3d與假傷組無顯著差異，7d后減輕高于假傷組水平(P<0.01)。腸內(nèi)營養(yǎng)組

19、和乳酸菌組體重減少量在各時相點無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.創(chuàng)傷性腦損傷小鼠小腸收縮運動1d后即出現(xiàn)受損，收縮幅度、頻率、平均張力降低，收縮模式紊亂不規(guī)律，直到第7d 仍未完全恢復(fù)?？赡芘cICC、平滑肌和神經(jīng)細(xì)胞的損傷有關(guān)。
　　 2.創(chuàng)傷性腦損傷小腸腸肌叢ICC 數(shù)量減少，ICC 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞，超微結(jié)構(gòu)損傷，這可能是導(dǎo)致腦損傷后動力障礙的重要因素。
　　 3.乳酸菌可以促進(jìn)小腸收縮運動的恢復(fù)，