苯甲酸雌二醇對去卵巢大鼠皮膚中TGFβ1-Smad3信號通路的影響.pdf

1、研究背景：
　　 衰老是自然生物界最基本的規(guī)律之一，其一直是科學(xué)家們感興趣的研究課題，近十余年來人們對衰老過程進行了大量的基礎(chǔ)性研究，皮膚衰老更是其中的熱點。就皮膚而言，長期以來人們就知道，進入絕經(jīng)期的婦女會出現(xiàn)皮膚干燥、易脫屑、易淤血損傷等現(xiàn)象;遭受損傷后又易引發(fā)靜脈性的潰瘍、壓瘡等慢性創(chuàng)面問題。采用雌激素治療后可明顯改善這些現(xiàn)象或阻止它們的發(fā)生。因此，皮膚作為“激素敏感性器官”的概念已為大家所接受。而雌激素與皮膚老化、創(chuàng)面愈

2、合關(guān)系的研究也越來越受到重視。但總體上較為零散、缺乏深度。從而在某種程度上也制約了雌激素替代治療（etrogenreplacementtherapy，ERT）的應(yīng)用。但隨著對雌激素作用機理的探明，選擇性調(diào)節(jié)雌激素藥物的出現(xiàn)，其在皮膚組織中的應(yīng)用將有極大的前景。因此，探討其機制已成為當前極為迫切的任務(wù)之一。
　　 皮膚衰老研究證實，膠原是人體細胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，膠原纖維約占真皮纖維的90％。研究表明，隨著年齡增長，皮膚膠原纖

3、維變細，真皮層變薄。一般嬰兒及青年人皮膚Ⅰ型膠原含量約占70％，Ⅲ型膠原占30％。當皮膚老化時，兩者比例逐漸倒置，膠原應(yīng)力傳導(dǎo)下降，抗剪切力減弱，膠原總含量減少，特別是可溶性膠原含量下降明顯，同時真皮乳頭層和網(wǎng)狀層彈性纖維減少及退化，膠原纖維和彈性纖維排列也漸趨紊亂，引起皺紋、松弛及下垂。皮膚的老化可分為內(nèi)源性老化和外源性老化兩類。內(nèi)源性老化指的是單純隨年齡增長而產(chǎn)生的皮膚改變，主要表現(xiàn)為上皮輕度變薄、彈性喪失和某些物質(zhì)的丟失。外源性老

4、化即環(huán)境因素引起的老化，主要指的是光化性老化(Photoaging)，由于日光中紫外線(Ultraviolet,UV)輻射是環(huán)境因素中導(dǎo)致皮膚老化的主要因素，所以皮膚外源性老化又稱為皮膚光老化[1]。皮膚光老化可通過一定的手段預(yù)防及治療，而內(nèi)源性老化則不可避免且呈持續(xù)性進展。隨著社會的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，影響組織衰老的因素極多，也極為復(fù)雜。雖然皮膚自身有較強的再生能力，但如何維持皮膚的彈性、延緩其老化仍是從古至今人類探求的重要課題。

5、　　 已有大量研究表明，雌激素對于延緩皮膚衰老具有顯著的作用，其作用途徑可能涉及多條細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且有進一步的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smads信號通路表達水平的上調(diào)，亦有助于改善皮膚的衰老狀況[2-4]。但由于雌激素在人體內(nèi)生物學(xué)作用的多樣性，使得目前有關(guān)雌激素及其受體延緩皮膚衰老的具體作用機制，特別是受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，尚不十分清楚，相關(guān)方面的研究在國內(nèi)外至今仍罕見報道。本課題旨在通過對衰老皮膚雌激素受體表達及信號轉(zhuǎn)

6、導(dǎo)通路的研究，了解皮膚衰老網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制，最終為臨床上科學(xué)有效的延緩皮膚衰老，盡可能的避免全身毒副作用，提供理論基礎(chǔ)和切實可行的治療手段。
　　 雌激素是主要由卵巢分泌的類固醇激素，它的主要作用是促進女性生殖器官的發(fā)育和第二性征的出現(xiàn)并維持其正常狀態(tài)，同時它影響全身主要器官系統(tǒng)的功能。皮膚是雌激素發(fā)揮作用的最大非生殖器官。雌激素對各種不同靶器官的生物學(xué)活性是由配體的結(jié)構(gòu)、雌激受體(ER)亞型等狀況來決定[5]。皮膚組織為雌激素的靶

7、組織，為雌激素替代治療延緩皮膚老化提供了可能。雌激素在皮膚中發(fā)揮重要的作用，主要表現(xiàn)在:(1)阻止皮膚老化。絕經(jīng)后女性皮膚發(fā)生深刻的變化:皮膚松弛和彈性下降、出現(xiàn)細小皺紋，同時皮膚干燥脫屑、修復(fù)功能減退、毛發(fā)數(shù)量減少等，組織學(xué)表現(xiàn)為:甘油聚糖濃度、水容量、膠原容量下降[6]，這些變化可以通過局部和系統(tǒng)應(yīng)用雌激素得到逆轉(zhuǎn)。(2)對皮膚損傷的修復(fù)作用。有人研究認為慢性損傷不易成功修復(fù)的原因是白細胞過度增多，膠原沉積下降。研究認為:局部應(yīng)用雌

8、激素可明顯逆轉(zhuǎn)老年病人損傷修復(fù)變慢的狀況。雌激素是一種損傷修復(fù)調(diào)節(jié)因子，在人類和動物模型中能逆轉(zhuǎn)年齡相關(guān)的損傷愈合[7]。(3)調(diào)節(jié)毛發(fā)生長:對女性AGA病人局部應(yīng)用雌二醇苯甲酸醋、雌二醇戊酸醋取得明顯的效果，它能使毛發(fā)生長期延長、休止期縮短[8]。(4)抑制皮脂腺分泌。雌二醇是機體中主要發(fā)揮作用的激素，其生物學(xué)效能最強。而苯甲酸雌二醇(estradio(l)benzoate，EB)則是臨床上進行雌激素替代治療(ERT)的主要藥物之一。

9、
　　 成纖維細胞是真皮中的主要細胞成分之一，它形成真皮中的膠原纖維、彈性纖維、基質(zhì)等。真皮中膠原水平的下降是導(dǎo)致絕經(jīng)后婦女老化外觀的主要原因之一。研究表明:應(yīng)用雌二醇對鼠真皮成纖維細胞進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)膠原合成增加約76％[9]。對大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn):在光損傷皮膚和正常皮膚組織中、局部雌激素是重要的結(jié)締組織調(diào)節(jié)因子，它能刺激新的結(jié)締組織帶的形成[10]。有人研究了年齡的老化和絕經(jīng)兩種因素對皮膚膠原的影響，結(jié)果表明，相對于年齡的老化

10、，絕經(jīng)對膠原的影響更為顯著，表明了激素對膠原合成和表達有非常重要的意義[11]。
　　 研究已證實了ER在人成纖維細胞中的分布[1213]。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)是傷口愈合中重要的調(diào)控因子，同時也被公認為最強的致纖維化因子，激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad3是其促進膠原合成的必由途徑[14]，因此推測:雌激素是否可以調(diào)控TGFβ1/Smad3信號通路以增加皮膚膠原蛋白的含量，而達到延緩皮膚老化的目的，并通過促進膠原蛋白合成及

11、抑制膠原蛋白降解兩條途徑來實現(xiàn)。雌激素是否對皮膚組織中TGFβ1/Smad3信號通路有影響，目前國內(nèi)外研究較少。本研究以去卵巢雌性大鼠為實驗對象，通過檢測苯甲酸雌二醇調(diào)節(jié)TGFβ1及Smad3蛋白的表達，探討雌激素延緩皮膚老化可能存在的相關(guān)機制。
　　 目的：
　　 建立絕經(jīng)期大鼠模型，觀察苯甲酸雌二醇對去卵巢雌性大鼠皮膚組織的抗衰老作用，初步探討延緩皮膚老化的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制。
　　 方法：
　　 1.絕經(jīng)

12、期動物模型的制備:雌性成年Wistar大鼠35只，清潔級，體質(zhì)量180±20g，由廣東省南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。將此大鼠隨機分為四組:A組:實驗對照組，n=5;B組:假手術(shù)組，n=10;C組:去卵巢組，簡稱為手術(shù)組，n=10;D組:去卵巢苯甲酸雌二醇治療組，簡稱為治療組，n=10。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后行腹部正中切口雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。以10％水合氯醛（300mg/kg）行腹腔注射麻醉，其中，假手術(shù)組只摘取雙側(cè)卵巢周圍少許脂肪組織，而手術(shù)組

13、和治療組均予以摘除雙側(cè)卵巢。手術(shù)切口均給予青霉素粉劑以預(yù)防感染。術(shù)后第四周開始，治療組給予肌肉注射苯甲酸雌二醇(estradiolbenzoate，EB)，生產(chǎn)廠家為上海通用藥業(yè)股份有限公司，0.2mg/kg，1次/3天;其余各組給予生理鹽水肌注，0.05ml/只，連續(xù)給藥四周。
　　 2.病理標本制備及免疫組化實驗:四周后處死各組大鼠，脫毛后取大鼠背部正中皮膚約0.5cm×0.5cm，乙醚脫脂處理，經(jīng)10％甲醛溶液固定，常規(guī)石

14、蠟包埋、連續(xù)切片，行HE染色，并同時進行免疫組化實驗(SP二步法)測定TGFβ1及Smad3的表達情況。
　　 3.病理學(xué)觀察:光鏡200倍視野下觀察各組大鼠皮膚組織的病理學(xué)變化。
　　 4.圖像分析:使用BX-51正置熒光顯微鏡（Olympus公司），選擇200倍視野，每張免疫組化片任選4個視野，拍照后用電腦數(shù)字軟件(Image-proplus.Version6.3.1.542)進行圖像分析，測定平均光密度值，所測數(shù)據(jù)

15、導(dǎo)入Excel，建立數(shù)據(jù)庫。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)處理:數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS13.0軟件進行分析，所有計量資料均以(x)±S表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計前均進行方差齊性檢驗，若方差齊，使用one-wayANOVA;而假手術(shù)組、手術(shù)組及治療組分別與實驗對照組兩兩比較時用Dunnett-t法(2-sided)，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 經(jīng)Levene方差齊性檢驗，各組TGFβ1、Smad3平均光密度值總體方

16、差齊(P=0.100，P=0.688)。經(jīng)one-wayANOVA分析得知，四組間TGFβ1、Smad3平均光密度值均數(shù)不全相等，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1127.262，F(xiàn)=1222.970，P＜0.001)。與對照組相比，治療組大鼠皮膚組織中的TGFβ1及Smad3表達升高(P＜0.001);假手術(shù)組與對照組相比，其TGFβ1及Smad3的表達無變化(P=0.808，P=0.694);手術(shù)組與對照組相比，其TGFβ1及Smad3的表