也木勒白羊卵泡抑制素α亞基DNA疫苗免疫原性及RNA干擾效果初步研究.pdf

1、抑制素(INH)又稱卵泡抑制素或性腺抑制素，是一種主要由卵巢顆粒細胞和睪丸支持細胞分泌產生的糖蛋白質激素，由一個α亞基和一個β亞基通過二硫鍵構成，其中抑制素α亞基（INHα）是抑制素發(fā)揮生理功能必不可少的。抑制素主要生理功能是抑制促卵泡素(FSH)的釋放，對雌性動物主要表現(xiàn)為調節(jié)卵泡的生成，增加成熟的優(yōu)勢卵泡數(shù)量；對雄性動物主要表現(xiàn)為促進精子的發(fā)生，提高睪丸的生精能力；還對雌雄動物共同表現(xiàn)為促使性成熟提前。因此，可通過調節(jié)抑制素α亞基基

2、因在機體內的表達量，降低體內抑制素水平，促進卵泡發(fā)育和精子的生成，最終提高動物的繁殖力。
　　目前主要通過兩種途徑降低動物體內抑制素的水平，其一是通過對動物進行主動或被動免疫抑制素原來使得機體內抑制素抗體含量增加，中和動物體內所分泌的抑制素，從而降低動物機體內的抑制素水平；其二是通過 RNA干擾技術下調抑制素α亞基基因 mRNA水平上的表達，最終致使動物機體內所分泌抑制素的量相對減少，降低在動物體內的抑制素水平。本研究運用了生物信

3、息學技術、基因克隆技術、蛋白質分析技術、基因免疫技術等以新疆塔城地區(qū)也木勒白羊卵泡抑制素α亞基作為選擇基因，對目的基因主要進行以下幾方面的研究試驗：
　　1、也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因的克隆及序列分析
　　為了克隆和序列分析也木勒白羊抑制素α亞基基因，根據(jù) GenBank檢索到的 INHα亞基基因序列(GenBank號：XM_004004955.1)設計一對特異性引物，本試驗采集發(fā)情期也木勒白羊卵巢組織為研究對象，從中快

4、速抽提總 RNA作為模板。利用基因克隆技術和現(xiàn)代生物技術對也木勒白羊 INHαcDNA進行克隆和測序及序列分析。測序及分析結果：也木勒白羊抑制素基因全長為1109bp，其中只含有1083bp組成開放閱讀框(ORF)，其起始密碼子為 ATG，終止密碼子為 TAA，含完整的抑制素α亞基亞基序列編碼區(qū)，共編碼360個氨基酸殘基。將所得序列提交到 GenBank，獲得登錄號：KP-113678。
　　2、也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因真核

5、表達載體的構建
　　對也木勒白羊抑制素α亞基基因進行克隆和序列分析的基礎上，采用定向克隆技術，構建也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因與綠色熒光蛋白基因融合表達載體 pEGFP- INHα，并對所構建的真核表達載體 pEGFP-INHα，運用菌液 PCR、雙酶切、測序、BHK-21細胞瞬轉及蛋白表達等試驗進行鑒定。結果：本次試驗成功構建了含也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因的綠色熒光真核表達載體(pEGFP-INHα)，并在 BHK-21細

6、胞中獲得了分泌型表達，轉染率高達70％以上。檢測到的該基因蛋白表達分子量約為40KD，該載體的構建為抑制素基因疫苗的研制奠定了一定基礎。
　　3、也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因疫苗對家兔生殖激素的影響
　　為了初步研究構建的也木勒白羊卵泡抑制素α亞基綠色熒光真核表達載體（pEGFP-INHα）的免疫原性，在本實驗中根據(jù)基因免疫技術，以成功制備的抑制素重組質粒 pEGFP-INHα為免疫原，對30只家兔進行基因免疫試驗，應用酶

7、聯(lián)免疫法(ELISA)檢測抗抑制素抗體，放射免疫法(RIA)測定處理后不同時期血清中部分生殖激素水平。結果：重組質粒 pEGFP-INHα免疫家兔后，各實驗組抗體滴度均顯著高于對照組(P<0.05)，且在第2次加強免疫后抗體水平明顯上升。首次免疫后，促卵泡素(FSH)和雌二醇(E2)平均含量均高于對照組，且在第2次加強免疫階段差異顯著，但在兩次免疫前后促黃體素（LH）均無明顯變化。這些結果表明：抑制素基因免疫家兔可降低抑制素的含量，促進

8、 FSH和 E2分泌，進而影響動物卵泡發(fā)育和誘導動物多產。
　　4、也木勒白羊卵泡抑制素α亞基基因靶向 SiRNA真核表達載體的構建
　　為了構建也木勒白羊抑制素α亞基基因靶向 SiRNA真核表達載體，根據(jù)本課題上傳至 GenBank的 INHα基因序列（GenBank號：KP-113678.1）設計3個不同位點的干擾片段，利用 RNAi技術和實驗室常規(guī)方法將3個干擾片段同時連接到同一個小 RNA專用真核表達載體中，并對其進