GLP-1對(duì)氧化激誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus，DM)以長(zhǎng)期慢性高血糖為發(fā)病基礎(chǔ)，胰島素分泌缺陷和（或）胰島素抵抗為特征的一組代謝性疾病。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式的改變，糖尿病患病率顯著增加。多種代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，從而引起一系列的糖尿病血管并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計(jì)糖尿病血管并發(fā)癥已成為糖尿病致殘致死的主要原因，因此保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)糖尿病患者具有重要意義。糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制主要包括多元醇通路、蛋白激酶C活化、

2、糖基化終產(chǎn)物形成及其受體活化、己糖胺途徑和氧化應(yīng)激水平升高等，其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為是始動(dòng)環(huán)節(jié)及關(guān)鍵因素。因此本研究采用H2O2刺激內(nèi)皮細(xì)胞制備氧化應(yīng)激模型模擬糖尿病血管病變。胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide1，GLP-1)是由腸道L細(xì)胞分泌的一種肽類激素，通過葡萄糖依賴的方式作用于胰島β細(xì)胞，促進(jìn)胰島素的生物合成和分泌。研究表明GLP-1還可刺激胰島β細(xì)胞的增殖和分化，抑制胰島β細(xì)胞凋亡，增加胰島β細(xì)胞數(shù)量，

3、同時(shí)還可抑制胰高血糖素的分泌、減少肝糖原的輸出等。GLP-1不僅能夠降低血糖、維持血糖穩(wěn)定，還能抑制食欲，但是因其半衰期極短，易被體內(nèi)二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl proteaseⅣ，DPP-Ⅳ)降解，因此在臨床應(yīng)用方面受到了限制。GLP-1類似物及DPP-Ⅳ抑制劑克服了其半衰期短的缺陷，因此逐漸應(yīng)用于2型糖尿病的臨床治療。近年來(lái)有研究表明GLP-1不僅能夠降低血糖，維持血糖穩(wěn)定，同時(shí)對(duì)心血管具有重要的保護(hù)作用，不僅可減輕血管的炎

4、性損傷，其受體激動(dòng)劑還可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，對(duì)損傷的血管進(jìn)行修復(fù)，但其對(duì)H2O2所致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是否具有保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究以H2O2刺激原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞制備氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，觀察經(jīng)GLP-1(7-36)干預(yù)后是否能降低H2O2所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
　　方法:①人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng):采用膠原酶灌注消化法分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，接種至包被有多聚賴氨酸的25cm2的培養(yǎng)瓶中，24h后更換培養(yǎng)液，以后每隔2d換液1

5、次。當(dāng)原代細(xì)胞融合85％-90％以上后，加入0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA溶液消化，傳代培養(yǎng)。第四代內(nèi)皮細(xì)胞用于測(cè)定細(xì)胞活力。②人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定:應(yīng)用兔抗人Ⅷ因子單克隆抗體對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。③CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力:顯微鏡下觀察，將長(zhǎng)至大約70％的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，隨機(jī)分為5組，每組中分別加入0μM、100μM、200μM、400μM、800μM的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)8、16、2

6、4 h，到達(dá)規(guī)定時(shí)間，于450nm處用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算各組別細(xì)胞存活率，選定合適的刺激濃度及時(shí)間。⑤GLP-1(7-36)干預(yù)后CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力:將長(zhǎng)至70％的內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組及刺激組，刺激組加入200μM的H2O2的同時(shí)分別加入0nM、100nM、200nM、400nM、800nM的GLP-1(7-36)孵育24小時(shí)，測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。⑤統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)采用(x)±s表示。用SPSS13

7、.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鑒定:兔抗人Ⅷ因子單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕黃色，反應(yīng)物分布于內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。染色結(jié)果顯示，第一代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞體飽滿，呈梭形或多邊形，細(xì)胞表面光滑，邊界清楚。
　　2、細(xì)胞活力測(cè)定:不同濃度的H2O2刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間后，細(xì)胞活力明顯降低(P＜0.05）

8、，并且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，其中給予200μM H2O2刺激24h細(xì)胞存活率降低至67％。
　　3、給予GLP-(7-36)干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞的活力明顯上升，從200nMGLP-1(7-36)干預(yù)濃度其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），并且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，其中200nM GLP-1(7-36)干預(yù)后細(xì)胞活力上升至88％。
　　結(jié)論:
　　1、H2O2刺激可引起內(nèi)皮細(xì)胞活力明顯下降，提示氧化應(yīng)激引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是