銀杏黃酮山萘酚和異鼠李素的體外代謝與藥物相互作用研究.pdf

1、銀杏(Ginkgobiloba)，是我國(guó)特有的珍稀樹(shù)種，俗稱“活化石”。銀杏葉味微苦，性平，其提取物的藥理作用有以下幾個(gè)方面：①改善心腦血管循環(huán)；②降低血清膽固醇；③抗菌消炎；④抗病毒；⑤清除自由基，抗氧化作用等。近幾年來(lái)，由于人們對(duì)銀杏葉藥用價(jià)值的認(rèn)識(shí)水平不斷提高，相關(guān)制品已成為治療心腦血管動(dòng)脈硬化、高血壓、糖尿病、腦中風(fēng)、各種惡性腫瘤、老年性癡呆等多種疾病的首選天然藥物。 體內(nèi)外研究表明銀杏黃酮成分在小腸被吸收后，在小腸和肝

2、內(nèi)進(jìn)行代謝，其主要代謝途徑為葡醛酸結(jié)合反應(yīng)。但由于體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，銀杏黃酮體內(nèi)代謝產(chǎn)物不盡相同。 中藥可以誘導(dǎo)抑制肝藥酶，如銀杏葉成分槲皮素和山萘酚可以引起大鼠和人肝微粒體CYP1A1、1A2、3A4、2B蛋白活性降低。另外銀杏葉制劑作為一種心血管疾病的治療藥物，需要長(zhǎng)期服用，在此期間有可能同時(shí)服用其他藥物，多種藥物合用，由于其中某一種成分對(duì)藥酶的誘導(dǎo)抑制作用，引起共服的其他藥物體內(nèi)處置發(fā)生變化，易產(chǎn)生藥物相互作用，導(dǎo)致不良反

3、應(yīng)的發(fā)生。目前中草藥與西藥合用現(xiàn)象很普遍，由中藥引起的藥物相互作用已引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，國(guó)外學(xué)者已開(kāi)展了相應(yīng)的研究工作，相關(guān)文獻(xiàn)逐年增加，但國(guó)內(nèi)有關(guān)中藥相互作用的研究文獻(xiàn)甚少。 本實(shí)驗(yàn)以銀杏黃酮山萘酚、異鼠李素和槲皮素為研究對(duì)象，以HPLC，LC/MS法為檢測(cè)手段，對(duì)以下三方面內(nèi)容進(jìn)行研究：1)銀杏黃酮苷元山萘酚和異鼠李素在不同來(lái)源的肝微粒體中的體外代謝；2)山萘酚對(duì)一相代謝酶的抑制作用；3)三種黃酮苷元相互作用以及銀杏黃酮

4、與其他藥物的相互作用。以闡明銀杏黃酮山萘酚、異鼠李素的代謝途徑和對(duì)藥酶的抑制作用，探討銀杏黃酮與其他藥物(或各成分)之間的相互作用，為進(jìn)一步研究銀杏成分的體內(nèi)過(guò)程奠定基礎(chǔ)。 一、山萘酚和異鼠李素的體外代謝 目的研究銀杏黃酮山萘酚和異鼠李素在不同種族(鼠、犬和人)、不同來(lái)源(誘導(dǎo)與未誘導(dǎo))的肝微粒體中的一相和二相代謝作用，明確介導(dǎo)山萘酚和異鼠李素代謝的主要藥酶，獲得兩者代謝的主要途徑。方法1)山萘酚和異鼠李素在鼠肝微粒體中

5、的一相代謝。取山萘酚(或異鼠李素)，分別與苯巴比妥(PB)、地塞米松(DEX)或β-萘黃酮(BNF)誘導(dǎo)的鼠肝微粒體(1mg蛋白質(zhì)·mL-1)于37℃下共孵育，孵育一定時(shí)間后加6﹪HClO4終止反應(yīng)，10000r·min-1離心，取上清液，HPLC法測(cè)定山萘酚(或異鼠李素)的剩余濃度。以未誘導(dǎo)處理的鼠肝微粒體為對(duì)照，比較不同誘導(dǎo)劑處理的鼠肝微粒體對(duì)山萘酚(或異鼠李素)一相代謝的催化活性。2)山萘酚和異鼠李素在鼠肝微粒體中的二相代謝。采用

6、苯巴比妥(PB)、地塞米松(DEX)、β-萘黃酮(BNF)和地非三唑(DIPH)誘導(dǎo)SD大鼠，與未誘導(dǎo)大鼠分別作為體外代謝的5種不同酶源。取一定量山萘酚(或異鼠李素)與鼠肝微粒體(0.2mg蛋白質(zhì)·mL-1)在25℃下共孵育，用6﹪HClO4終止反應(yīng)，乙醚-丙酮溶液提取，HPLC法測(cè)定剩余底物或產(chǎn)物濃度，LC-MS法分析代謝物結(jié)構(gòu)。以未作任何處理的鼠肝微粒體為對(duì)照，比較不同誘導(dǎo)劑處理的鼠肝微粒體對(duì)山萘酚(或異鼠李素)代謝的催化活性。3)

7、山萘酚和異鼠李素在人肝或犬肝微粒體中的二相代謝。按鼠肝微粒體中的方法操作，但人肝微粒體蛋白濃度為1mg·mL-1，孵育溫度為37℃。犬肝微粒體蛋白濃度和孵育溫度同鼠肝微粒體。結(jié)果1)山萘酚在BNF誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中的一相代謝反應(yīng)相對(duì)較強(qiáng)，孵育60min后，有18.26﹪量被代謝，其中一個(gè)代謝產(chǎn)物為槲皮素，而在對(duì)照組和其他誘導(dǎo)劑處理的微粒體中代謝甚微(代謝率為3～7﹪)。異鼠李素在不同鼠肝微粒體中代謝均不明顯(代謝率為2～8﹪)。2)山萘

8、酚和異鼠李素在BNF和DIPH誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中有較強(qiáng)的二相代謝作用，而在PB、DEX誘導(dǎo)的鼠肝微粒體和對(duì)照組微粒體中的代謝較弱。40μg·mL-1的山萘酚在微粒體中孵育45min后，分別有62.9﹪(DIPH)，40.1﹪(BNF)，21.1﹪(PB)，23.7﹪(DEX)和18.0﹪(對(duì)照組)的量被代謝。測(cè)得山萘酚在對(duì)照組、BNF和DIPH誘導(dǎo)的微粒體中的Km值分別為(1.85±1.05)，(9.41±2.45)和(72.4±3.0

9、8)μmol·L-1；vmax值為(2.45±0.63)，(7.55±1.40)和(25.2±1.08)μmol·g-1·min-1。40μg·mL-1的異鼠李素經(jīng)60min孵育后，分別有70.9﹪(DIPH)，43.7﹪(BNF)，26.3﹪(PB)，26.8﹪(DEX)和19.2﹪(對(duì)照組)的量被代謝。測(cè)得異鼠李素在對(duì)照組、BNF和DIPH誘導(dǎo)的微粒體中的Km值分別為(1.95±0.54)，(7.13±0.73)和(61.4±6.5

10、0)μmol·L-1；vmax值為(1.15±0.17)，(3.05±0.26)和(22.7±2.13)μmol·g-1·min-1。檢測(cè)到山萘酚的二個(gè)葡醛酸結(jié)合產(chǎn)物和一個(gè)未知代謝產(chǎn)物；異鼠李素有四個(gè)代謝產(chǎn)物被檢出，經(jīng)HPLC-MS分析，均為一分子的葡醛酸結(jié)合物。3)山萘酚和異鼠李素在人肝微粒體中的二相代謝較弱。孵育60min后，僅16.04﹪的山萘酚或13.36﹪的異鼠李素被代謝。山萘酚和異鼠李素在犬肝微粒體中分別代謝19.55﹪和2

11、1.12﹪，代謝程度與空白鼠肝微粒體較接近。結(jié)論1)山萘酚和異鼠李素的一相代謝作用相對(duì)較弱，僅在BNF誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中觀測(cè)到山萘酚的3'-位羥化反應(yīng)(轉(zhuǎn)變成槲皮素)。2)山萘酚和異鼠李素在不同誘導(dǎo)劑處理的鼠肝微粒體中有不同程度的葡醛酸結(jié)合代謝反應(yīng)，其中BNF和DIPH誘導(dǎo)的鼠肝微粒體對(duì)山萘酚和異鼠李素的葡萄糖醛酸苷結(jié)合反應(yīng)起主導(dǎo)作用。3)相對(duì)于鼠肝微粒體，在人肝微粒體中山萘酚和異鼠李素的葡醛酸結(jié)合反應(yīng)最弱，犬肝微粒體次之。 二

12、、山萘酚對(duì)細(xì)胞色素P450的抑制作用 目的：研究山萘酚對(duì)鼠肝微粒體中CYP的抑制作用。方法：選擇細(xì)胞色素P4501A，2B，3A的專屬底物乙氧基異吩惡唑(ER)，戊氧基異吩惡唑(PR)和地西泮、睪酮、硝苯地平與山萘酚分別在BNF，PB，DEX誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中于37℃下共孵育一定時(shí)間。加冰甲醇中止反應(yīng)，10000r·min-1離心，取上清液，熒光法測(cè)定ER或PR的代謝產(chǎn)物異吩惡唑的濃度，HPLC法測(cè)定底物地西泮、睪酮或硝苯地平的

13、剩余濃度，用Dixon圖來(lái)計(jì)算抑制常數(shù)Ki值。山萘酚對(duì)以上底物的抑制常數(shù)Ki值分別與CYP1A，2B，3A的典型抑制劑氟伏沙明、司可巴比妥鈉和酮康唑的抑制常數(shù)Ki值進(jìn)行比較。結(jié)果：(1)山萘酚對(duì)ER脫乙氧基形成異吩惡唑的代謝反應(yīng)有強(qiáng)的抑制作用，抑制常數(shù)Ki為5.86±0.84μmol·L-1，其對(duì)ER代謝的抑制能力約為氟伏沙明(Ki為11.03±0.27μmol·L-1)的2倍。山萘酚對(duì)戊氧基異吩惡唑代謝的抑制常數(shù)Ki為7.78±1.3

14、6μmol·L-1，與司可巴比妥鈉的抑制常數(shù)(Ki為6.65±2.41μmol·L-1)較為接近。山萘酚對(duì)地西泮，睪酮，硝苯地平的代謝有弱的抑制作用，與CYP3A酶的特異性抑制劑酮康唑相比，抑制能力要弱得多，測(cè)得山萘酚對(duì)地西泮，睪酮，硝苯地平的抑制常數(shù)在86～183μmol·L-1范圍，而酮康唑的抑制常數(shù)在1.83～2.83μmol·L-1范圍。結(jié)論：山萘酚能顯著抑制CYP1A酶和CYP2B酶的活性，而對(duì)CYP3A酶的抑制作用較弱。

15、 三、銀杏黃酮山萘酚與其它黃酮成分或藥物的代謝性相互作用。 目的：研究山萘酚與槲皮素、異鼠李素以及可能與之合用的藥物在鼠肝微粒體中的代謝相互作用。方法：1)取銀杏黃酮苷元山萘酚、異鼠李素、槲皮素，采用兩兩共孵育的方法，分別以一個(gè)成分為底物，另一成分為抑制劑，在BNF誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中于25℃下共孵育一定時(shí)間。6﹪HClO4終止反應(yīng)，10000r·min-1離心，取上清液，HPLC法測(cè)定底物的剩余濃度，計(jì)算各黃酮成分對(duì)其他黃酮

16、成分的抑制常數(shù)Ki值。2)選用幾種UGT的底物(撲熱息痛、異丙酚、對(duì)硝基苯酚、鹽酸多巴酚丁胺)與山萘酚在BNF誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中共孵育，采用HPLC法分別測(cè)定孵育液中底物山萘酚的剩余濃度，計(jì)算這些共孵育底物對(duì)山萘酚的抑制常數(shù)(Ki值)。3)觀察山萘酚對(duì)鹽酸普萘洛爾在BNF誘導(dǎo)的鼠肝微粒體中的一相代謝的抑制程度。結(jié)果：1)銀杏黃酮三種成分之間相互有較強(qiáng)的抑制作用，抑制常數(shù)分別為：山萘酚對(duì)槲皮素和異鼠李素的Ki值為4.64±3.45μmol

17、·L-1和18.42±3.87μmol·L-1；槲皮素對(duì)山萘酚和異鼠李素的Ki值為11.10±0.30μmol·L-1和2.26±0.99μmol·L-1；異鼠李素對(duì)山萘酚和槲皮素的Ki值為24.99±2.87μmol·L-1和5.27±2.40μmol·L-1。2)UGT底物撲熱息痛、異丙酚、鹽酸多巴酚丁胺對(duì)山萘酚二相代謝基本無(wú)抑制作用，對(duì)硝基苯酚對(duì)山萘酚有微弱的抑制，抑制常數(shù)Ki為204.0±8.66μmol·L-1。3)山萘酚對(duì)鹽