天然產物-中藥的代謝相互作用與藥效和安全的體外研究.pdf

1、第一部分：艾靈顆粒對茚地那韋的體外代謝性增效作用
　　背景:高效抗逆轉錄病毒療法(Highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART)俗稱抗艾滋病毒的“雞尾酒療法”,是目前公認的最有效治療艾滋病感染的方法,其可以有效延長患者的壽命和改善患者的生活質量。茚地那韋(indinavir)在HAART。療法中占有十分重要的地位,與逆轉錄病毒制劑(如:核苷或非核苷類逆轉錄酶抑制劑)合用能治療成人的HIV-I感染。

2、茚地那韋是蛋白酶抑制劑,能阻礙病毒顆粒成熟過程中病毒前體多蛋白的裂解,使產生的病毒顆粒不具有感染性,無法啟動新一輪感染。但是,茚地那韋在肝臟有強烈的首過代謝(FirstPassMetabolism)作用,人體生物利用度僅為65％,從而造成了劑量大和療效安全窗口小的缺陷。如何利用中藥優(yōu)勢,提高抗HIV化學藥的療效和減輕毒副作用,是中西醫(yī)結合治療艾滋病的一個突破口。本課題第一部分是在前人應用體外人肝系統,從十余種中成藥中篩選出與茚地那韋具有

3、相似代謝特征的艾靈顆粒并確定其提取物對CYP3A4有抑制作用的基礎上,進行以下兩個內容的研究:一是茚地那韋在人、SD大鼠、CD1小鼠、獼猴和比格犬肝微粒體的代謝穩(wěn)定性試驗,試驗的目的是為了篩選出與人代謝特征最接近的動物,進行臨床前動物試驗來驗證艾靈顆粒對茚地那韋的代謝性作用。二是采用人肝微粒體和比格犬肝微粒體為模型,研究艾靈顆粒對茚地那韋的體外代謝性作用。目的:研究茚地那韋在人、SD大鼠、CD1小鼠、獼猴和比格犬肝微粒體上的代謝穩(wěn)定性特

4、征。并且以人和比格犬微粒體為模型,研究艾靈顆粒對茚地那韋的體外代謝性增效作用。方法:(1)茚地那韋在人肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性試驗,茚地那韋及微粒體都先加入96深孔板中,在CO2培養(yǎng)箱37℃下預孵育15分鐘后,在實驗組和陽性對照組(普納洛爾)中加入NADPH(5mmo1·L-1)使反應開始,在空白對照組中則加入磷酸緩沖液,再放入CO2培養(yǎng)箱37℃下繼續(xù)孵育。實驗組和陽性對照組分別在孵育O、5、15、30、60和120分鐘時,在上述反應體系

5、中取出100μL后加入500μL冰冷的甲醇終止反應(含有內標柳胺酚),而在空白對照組則是在0、60、120分鐘時在反應體系中取出100μL后加入500μL的冰冷的甲醇終止反應(含有內標柳胺酚)。離心最后的混合物(4000RPM)10分鐘,目的是為了使蛋白質沉淀完全,減少對LC/MS/MS儀器的污染。取上層清液用于LC/MS/MS分析。茚地那韋在SD大鼠、CD1小鼠、獼猴和比格犬肝微粒體上的代謝穩(wěn)定性試驗方法與人肝微粒體試驗方法相同。(2

6、)在實驗組,艾靈顆粒(0、20和40mg.mL-1)及健康人肝微粒體或比格犬肝微粒體都先加入96深孔板中;在陽性對照組和空白組,磷酸緩沖液和健康人肝微粒體或比格犬肝微粒體都先加入96深孔板中,所有的組都在CO2培養(yǎng)箱37℃下孵育15分鐘。在實驗組中加入茚地那韋,陽性對照組加入普納洛爾,在空白對照組中則加入磷酸緩沖液,接著前兩組再加入NADPH(2mmo1·L-1)使反應開始,最后一組則加入磷酸緩沖液,所有的組再放入CO2培養(yǎng)箱37℃下繼

7、續(xù)孵育。實驗組和陽性對照組分別在孵育O、15、30、60和120分鐘時,在上述反應體系中取出100μL,后加入500μL冰冷的甲醇終止反應(含有內標柳胺酚),而在空白對照組則是在O、120分鐘時在反應體系中取出100μL后加入500μL的冰冷的甲醇終止反應(含有內標柳胺酚)。離心最后的混合物(4000RPM)10min,目的是為了使蛋白質沉淀完全,減少對LC/MS/MS儀器的污染。取上層清液用于LC/MS/MS分析。研究艾靈顆粒在狗肝微

8、粒體中對茚地那韋的體外代謝性增效作用與人肝微粒體的實驗方法相同。結果:(1)茚地那韋在人、SD大鼠、CD1小鼠、獼猴子和比格犬肝微粒體的半衰期分別是17.17、4.02、1.90、5.23和4.18分鐘;內在清除率是101.2、680.4、2872.3、387.4和827.4ml-min-1.kg-1;肝清除率是17.2、51.1、87.3、39.5和29.8ml.min-1.kg-1。(2)在人和比格犬肝微粒體中,艾靈顆粒能明顯抑制茚

9、地那韋的代謝,使茚地那韋在各個時間的剩余量明顯增加。結論:茚地那韋在SD大鼠、獼猴和比格犬肝微粒體的代謝特征與其在人肝微粒體上的代謝特征相似。但是考慮到時間、經濟等問題,且參考了一些文獻上關于茚地那韋的種屬差異性結果,最后我們認為比格犬是研究艾靈顆粒對茚地那韋體內代謝性作用的最佳動物模型。此外,在人和比格犬肝微粒體中,艾靈顆粒能明顯抑制茚地那韋的代謝。
　　第二部分：天然產物制品對人肝臟P450代謝同功酶的作用及其肝細胞毒性和機制

10、的體外研究
　　背景:隨著動物福利呼聲的提高,以替代(replacement)、減少(reduction)和優(yōu)化(refinement)動物試驗為核心的“3R”運動已逐漸被國際社會廣泛接受。肝臟是藥物最重要的代謝器官,是生物轉化的主要場所,所以以肝臟為基礎的體外替代實驗系統,如肝微粒體和肝細胞,在“3R”運動中起著重要的作用,其以特有的優(yōu)勢和特點在外源性物質代謝和毒性的研究中得到廣泛應用,其中外源性物質包括了藥物、農業(yè)物、污染物以

11、及飲食組分等。本課題第二部分是以人原代肝細胞模型和人的肝微粒體為模型,進行天然產物制品對人肝臟P450同功酶的作用及其肝細胞毒性和機制的體外研究。目的:按照ICCVAM(替代評價方法協調委員會)推薦的方法,應用體外細胞毒性評價方法和代謝性相互作用評價方法,研究天然產物制品的毒性作用及其代謝性活化或代謝性解毒機制。方法:用人肝微粒體,研究了天然產物制品對肝細胞色素P450亞酶的作用。用人超低溫凍存肝原代細胞,評價了5個進口天然產物制品的細

12、胞毒性(MTT方法)。應用化學抑制法,研究了細胞色素P4502A6,2C9,2C19和3A4對天然產物制品細胞毒性的影響。結果:天然產物制品TA-07-004和TA-07-005對CYP1A2有明顯的抑制作用,它們的IC50分別為初始濃度的0.22％和0.03％,且它們對CYP3A4也有明顯的抑制作用,它們的IC50分別為初始濃度的0.49％和0.2％。天然產物制品TA-07-003沒有肝細胞毒性,其余4個天然產物制品觀察到有肝細胞毒性