抗菌藥物敏感性試驗及細節(jié)耐藥檢測

1、1抗菌藥物敏感性試驗與菌藥物敏感性試驗與細節(jié)耐藥性監(jiān)測細節(jié)耐藥性監(jiān)測來源：檢驗醫(yī)學(xué)在線2009415南網(wǎng)編輯201076一、需氧菌及兼性厭氧菌的藥物敏感試驗一、需氧菌及兼性厭氧菌的藥物敏感試驗(一)紙片瓊脂擴散法紙片瓊脂擴散法紙片瓊脂擴散法又稱KirbyBauer試驗，是操作最簡易、使用最廣泛的抗菌藥物敏感性試驗。1試驗原理將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上。紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周圍區(qū)域擴散

2、形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度(MIC)呈負相關(guān)關(guān)系，即抑菌圈越大，MIC越小。2培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片(1)培養(yǎng)基：水解酪蛋白(MuellerHinton，MH)培養(yǎng)基是CLSINCCLS采用的兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標準培養(yǎng)基，pH值為7.2～7.4，對那些營養(yǎng)要求高的細菌如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、鏈球

3、菌等需加入補充物質(zhì)。瓊脂厚度為4mm。配制瓊脂平板當(dāng)天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前應(yīng)將平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。(2)抗菌藥物紙片：選擇直徑為6.35mm，吸水量為20ul的專用藥敏紙片用逐片加樣或浸泡方法使每片含量達到規(guī)定所示。含藥紙片密封儲存2～8℃或20℃無霜冷凍箱內(nèi)保存，β內(nèi)酰胺類藥敏紙片應(yīng)冷凍儲存，且不超過l周。使用前將儲存容器移至室溫平衡l～2h，避免開啟儲存容器時產(chǎn)生冷凝水。3細菌接種細菌接種采用直接菌

4、落或細菌液體生長方法。用0.5麥氏比濁標準的菌液濃度。校正濃度后的菌液應(yīng)在15min內(nèi)接種完畢。接種步驟如下：①用無菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后，在瓊脂表面均勻涂片接種3次，每次旋轉(zhuǎn)60，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；②平板置室溫下干燥3～5min，用紙片分離器或無菌鑷將含藥紙片緊貼于瓊脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后閱讀結(jié)果，對甲氧西林和萬古霉素藥敏感試驗結(jié)果應(yīng)孵育24h。4結(jié)果判斷和報告用精確度為1mm的游標卡

5、尺量取抑菌圈直徑(抑菌圈的邊緣應(yīng)是無明顯細菌生長的區(qū)域)，當(dāng)葡萄球菌對苯唑西林的藥敏試驗或腸球菌對萬古霉素的敏感試驗，圍繞紙片周圍只要有極少細菌生長提示為耐藥。對另外一些菌，在抑菌圈內(nèi)散在菌落生長提示可能是混合培養(yǎng)，必須再分離鑒定及試驗，也可能提示為高頻突變株。變形桿菌遷徙生長使抑菌圈內(nèi)生成的薄層菌可忽略不計。由于培養(yǎng)基內(nèi)抗藥成分使其對甲氧芐啶引起的輕微細菌生長，生長層小于20％可忽略不計。根據(jù)CLSINCCLS標準，對量取的抑菌圈直徑

6、判斷病原菌對該藥物的敏感性形式(敏感中度敏感中介、耐藥)。3如含頭孢克洛，在使用48h之內(nèi)制備平板，使用前應(yīng)在室溫中平穩(wěn)放于孵育箱或?qū)恿髡种?0min以使瓊脂表面干燥。(3)細菌接種：將0.5麥氏比濁度菌液稀釋10倍，以多頭接種器吸取(為1～2ul)接種于瓊脂表面，稀釋的菌液于l5min內(nèi)接種完畢，接種后置35℃孵育16～20h(MRS、VRE孵育時間需滿24h)，奈瑟菌屬、鏈球菌屬細菌置于5％C02、幽門螺桿菌置微需氧環(huán)境中孵育。(4

7、)結(jié)果判斷：將平板置于暗色、無反光表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的藥物稀釋度為終點濃度(含甲氧芐啶平板上可見少許散在細菌生長)。試驗菌的結(jié)果報告可用MIC(ugmg)或用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報告。(三)E)E試驗試驗E試驗(Epsilometertest)是一結(jié)合稀釋法和擴散法原理對細菌藥敏試驗直接定量的技術(shù)。1試驗原理E試條是一條5mm50mm的無孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗生素，

8、另一面有讀數(shù)和判別的刻度?？股氐奶荻瓤筛采w有20個MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍，其斜率和濃度范圍對判斷有臨床意義的MIC范圍和分界點值具有較好的關(guān)聯(lián)。將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗生素抑制細菌的特定濃度，又稱抑制濃度(IC)，它與MIC呈高度相關(guān)。2細茵接種和加樣使用厚度為4mmMH瓊脂平板，用0.5麥氏濃度的對數(shù)期菌液涂布，待瓊脂平板完全干燥，用E試驗

9、加樣器或鑷子將試條放在已接種細菌的平板表面，試條全長應(yīng)與瓊脂平板緊密接觸，試條MIC刻度面朝上，濃度最大處靠平板邊緣。采用CLSlNCCLSAST執(zhí)行標準推薦孵育條件。3結(jié)果判斷和報告讀取橢圓環(huán)與E試驗試條的交界點IC值。E試驗IC值與CLSlNCCLS的稀釋法MIC參考值高度相關(guān)，二者直接相對應(yīng)，CLSlNCCLSMIC折點值適用于E試驗。但在判斷結(jié)果時出現(xiàn)和細菌、藥物、耐藥機制和技術(shù)處理有關(guān)判斷問題時應(yīng)予以修正。二、苛養(yǎng)菌的藥物敏感