雞矢藤環(huán)烯醚萜苷含藥血清對體外培養(yǎng)新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的影響.pdf

1、疼痛是傷害性或潛在組織損傷引起的不愉快感覺,常伴有內(nèi)分泌、代謝、免疫和精神心理改變。課題組采用有機溶劑萃取、大孔樹脂層析等方法從野生雞矢藤中分離提取到其活性成份雞矢藤環(huán)烯醚萜總苷(Iridoidglycosidesofpaederiascandens,IGPS),主要包括車葉草苷(asperuloside)、雞矢藤苷(paederoside)及雞矢藤次苷(scandoside)等。中醫(yī)理論認為雞矢藤味酸、苦入肝胃而有滲利水濕、祛風活血、

2、舒筋活絡(luò)、止痛解毒等功效。前期研究結(jié)果顯示,IGPS對多種疼痛模型均具有良好的鎮(zhèn)痛作用,本實驗旨在研究IGPS含藥血清對體外培養(yǎng)新生大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglia,DRG)神經(jīng)元的影響,尋求IGPS含藥血清鎮(zhèn)痛作用的有效靶點,為其臨床提供充足的理論和實驗依據(jù)。
　　1.新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)
　　無菌條件下,取新生大鼠背根神經(jīng)節(jié),加入膠原酶-中性蛋白酶消化液,37℃CO2培養(yǎng)箱消化,加入5

3、-氟-2’脫氧尿苷(5-FUDR)以純化神經(jīng)元,MEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng),用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)免疫組織化學染色鑒定DRG神經(jīng)元的純度。
　　細胞生存狀態(tài)良好,可以純活兩周以上。低濃度的5-FUDR(10mmol/L)可以很好的純化DRG神經(jīng)元,細胞純度高于90％以上。
　　2.新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷模型的制備
　　DRG神經(jīng)元培養(yǎng)至第五天,狀態(tài)完全穩(wěn)定后加

4、入不同濃度(20、200、2000μmol/L)的NO供體硝普鈉(sodiumnitroprusside,SNP)作用于DRG神經(jīng)元15min,制備DRG神經(jīng)元損傷模型。經(jīng)臺盼藍染色顯示,在200μmol/L濃度SNP作用下,DRG神經(jīng)元的存活率為50%,DRG損傷程度最為適宜。
　　3.IGPS含藥血清的制備
　　SD大鼠隨機分組,IGPS(70、140、280mg/kg)灌胃(ig)給藥,每日2次,連續(xù)3d。末次灌胃1h

5、后固定大鼠,腹主動脈采血,4℃下靜置過夜,微孔濾膜濾過除菌分離血清,-20℃條件下保存?zhèn)溆?。各組含藥血清用細胞培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋。
　　4.IGPS含藥血清對新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元SNP損傷模型的影響
　　研究IGPS含藥血清對新生大鼠DRG神經(jīng)元影響及其可能機制。臺盼藍染色法及MTT法測定IGPS含藥血清對SNP損傷后DRG神經(jīng)元的存活率的影響;激光共聚焦顯微鏡檢測新生大鼠DRG神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度的變化;紫外分光

6、光度法測定新生大鼠DRG神經(jīng)元NO含量和iNOS活性;放射免疫分析法測定新生大鼠DRG神經(jīng)元cGMP的含量;RT-PCR法檢測新生大鼠DRG神經(jīng)元iNOSmRNA、PKGΙαmRNA和PKGIβmRNA的表達。
　　結(jié)果顯示,IGPS含藥血清(140、280mg/kg,ig)可以明顯抑制SNP損傷后DRG神經(jīng)元的死亡;IGPS含藥血清(280mg/kg,ig)組可有效抑制損傷DRG胞內(nèi)鈣離子濃度的升高;IGPS含藥血清(140、2