IGF-1緩解紫杉醇誘發(fā)的背根神經節(jié)神經元毒性的實驗研究.pdf

1、紫杉醇(paclitaxel，PT)是臨床上常用的抗腫瘤藥物，具有很好的抗腫瘤治療效果，但PT的神經毒性作用或PT誘發(fā)的周圍神經病變可使病人出現嚴重的神經病理性疼痛癥狀，而且這種疼痛癥狀用常規(guī)的鎮(zhèn)痛藥物難以緩解，嚴重影響進一步抗腫瘤治療。到目前為止，PT的神經毒性作用或PT誘發(fā)的周圍神經病變的發(fā)病機制還未完全被闡明。PT誘發(fā)的神經病理性疼痛癥狀與背根神經節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)初級傳入神經元的毒性有關。因此，研

2、究PT對DRG神經元表型變化的影響對于闡明PT的神經毒性作用機制具有一定的指導意義，探討緩解PT的神經毒性作用有助于開發(fā)PT誘發(fā)的周圍神經病變新的治療手段。本研究利用體外培養(yǎng)的DRG神經元和PT誘發(fā)的大鼠周圍神經病變模型研究胰島素樣生長因子-1（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）緩解PT誘發(fā)的神經毒性及其機制。
　　第一部分IGF-1對具有紫杉醇毒性的培養(yǎng)的背根神經節(jié)神經元的保護作用
　　根據

3、神經生化免疫反應的特殊標記可將DRG神經元分為神經肽免疫反應（neuropeptide-immunoreactive，NP-IR）和神經絲免疫反應(neurofilament-IR，NF-IR)神經元兩種主要表型。降鈣素基因相關肽（calcitoningene-relatedpeptide，CGRP）是一種在DRG神經元內表達并發(fā)揮多種生物學功能的感覺神經肽，CGRP-IR神經元可代表NP-IR神經元。神經絲(neurofilament

4、，NF)是神經元特異性中間絲，其中神經絲蛋白-200（neurofilament-200，NF-200）對正常神經元的維持發(fā)揮重要作用，NF-200-IR神經元可代表NF-IR神經元。PT是否能夠影響DRG神經元的神經化學表型目前仍不清楚。
　　IGF-1是一種促生長的肽類激素，通過激活其酪氨酸激酶受體IGF-1R促進神經元的存活。IGF-1及其受體IGF-1R均在DRG神經元有表達，IGF-1在促進DRG神經元軸突的生長及調控感

5、覺神經肽的表達方面發(fā)揮重要作用。IGF-1是否通過細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2(extracellularsignal-regulatedproteinkinase1/2，ERK1/2)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threoninekinase，Akt)信號通路調節(jié)PT誘發(fā)的DRG神經元的表型變化尚需進一步探討。
　　為了檢測PT神經

6、毒性作用的劑量依賴關系，將原代培養(yǎng)48h的DRG神經元分為以下各組:(1)PT0.01μmol/L;(2)PT0.1μmol/L;(3)PT1μmol/L;(4)對照組:DRG神經元僅在培養(yǎng)液內孵育作為對照。DRG神經元在以上條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h后，在倒置相差顯微鏡下觀察DRG神經元活細胞生長狀態(tài)，用微管相關蛋白-2(microtubule-associatedprotein2，MAP2)進行免疫熒光標記后測量單個神經元突起的長度。結果

7、顯示，DRG神經元突起長度的縮短與PT的濃度具有劑量依賴性。
　　為了檢測IGF-1對具有PT毒性的DRG神經元的保護作用，將原代培養(yǎng)48h的DRG神經元分為以下各組:(1)PT(1μmol/L);(2)PT(1μmol/L)+IGF-1(20nmol/L);(3)ERK1/2抑制劑PD98059(10μmol/L)+PT(1μmol/L)+IGF-1(20nmol/L);(4)PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)+

8、PT(1μmol/L)+IGF-1(20nmol/L);(5)對照組:DRG神經元僅在培養(yǎng)液內孵育作為對照。DRG神經元在以上條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h后，在倒置相差顯微鏡下觀察DRG神經元活細胞生長狀態(tài)，用MAP2進行免疫熒光標記后測量單個神經元突起的長度，用WST-1檢測DRG神經元細胞活力，用Hoechst33342染色法檢測DRG神經元細胞凋亡，用MAP2和CGRP或NF-200免疫熒光雙標記檢測DRG神經元表型的變化，用real-t

9、imePCR分析技術檢測CGRPmRNA和NF-200mRNA的表達變化，用Westernblot分析技術檢測CGRP和NF-200蛋白的表達。結果顯示，PT可影響DRG神經元的生長狀態(tài)，使DRG神經元突起的長度變短，細胞活力減低，細胞凋亡率升高，CGRP-IR神經元和NF-200-IR神經元表型的比例、CGRP和NF-200蛋白及其mRNA的水平下降;IGF-1可使具有PT毒性的DRG神經元的突起延長，細胞活力增加，細胞凋亡率降低，I

10、GF-1可挽救PT誘發(fā)的CGRP-IR神經元表型的比例下降，但對NF-200-IR神經元表型的變化沒有影響;IGF-1對DRG神經元生長狀態(tài)的改善和對DRG神經元特定表型的影響作用是通過激活ERK1/2和PI3K/Akt細胞信號轉導通路而實現的。本研究的結果表明，IGF-1可通過抑制具有PT毒性的DRG神經元凋亡而增加神經元細胞活力和促進神經元突起的生長，IGF-1主要是對支配皮膚的DRG神經元產生保護作用，PT對DRG神經元不同亞群的

11、神經毒性作用以及IGF-1對具有PT毒性的特定神經元表型神經營養(yǎng)作用，為進一步研究IGF-1緩解PT誘發(fā)的神經毒性提供了實驗依據。
　　第二部分IGF-1緩解紫杉醇誘發(fā)的神經病理性疼痛的實驗研究
　　由于PT的神經毒性可誘發(fā)周圍神經病變，這種周圍神經病變的神經病理性疼痛癥狀用常規(guī)的鎮(zhèn)痛藥物難以緩解。因此，通過神經營養(yǎng)的角度改善神經元的功能狀態(tài)，是緩解這種周圍神經病變所致的神經病理性疼痛癥狀的一個具有研究前景和應用前景的領域。

12、IGF-1對不同神經損傷的改善作用和其特有的神經營養(yǎng)作用，以及IGF-1通過激活特有的細胞信號轉導通路而發(fā)揮生物學效應的特性，提供了通過干預新的潛在性治療靶點緩解PT誘發(fā)的神經病理性疼痛的可行性。因此，本研究利用腹膜腔注射（intraperitoneallyinjection，i.p.）PT建立PT誘發(fā)的神經病理性疼痛大鼠動物模型，分別鞘內注射IGF-1、ERK1/2抑制劑PD98059+IGF-1、PI3K抑制劑LY294002+IG

13、F-1，檢測各組大鼠觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值的變化和L4～6DRG神經元CGRP和NF-200及其mRNA的表達變化。結果顯示，PT可使大鼠觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值降低，鞘內注射IGF-1可使大鼠觸覺痛覺閾值和熱痛覺閾值升高，并使其提前恢復至正常水平，預先鞘內注射ERK1/2抑制劑PD98059或PI3K抑制劑LY294002可阻斷IGF-1的效應。PT可使大鼠L4～6DRG神經元CGRP及其mRNA的表達上調，而NF-200及其mRN

14、A的表達下調。而鞘內注射IGF-1后，DRG神經元CGRP及其mRNA的表達趨于正常，而NF-200及其mRNA的表達則不受IGF-1的影響。IGF-1所致的DRG神經元CGRP及其mRNA的表達變化效應可被預先鞘內注射ERK1/2抑制劑PD98059或PI3K抑制劑LY294002所阻斷。這些結果表明，IGF-1可通過ERK1/2和PI3K/Akt細胞信號轉導通路緩解PT誘發(fā)的神經病理性疼痛，這可能是由于IGF-1改善了不同亞群的DR