碳納米管載藥在提高抗氧化劑療效方面的研究.pdf

1、正常妊娠過(guò)程的維持依賴于完整而正常的胎盤功能。大量研究表明，子宮-胎盤組織特別是滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激在子癇前期、胎兒宮內(nèi)窘迫、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、流產(chǎn)等妊娠疾病的發(fā)病中起重要作用。因此，抗氧化物質(zhì)的治療作用也越來(lái)越受到重視。但是，由于大分子抗氧化物質(zhì)不易進(jìn)入細(xì)胞以及高劑量小分子抗氧化劑反而會(huì)損害胎盤功能等缺點(diǎn)，構(gòu)建一個(gè)細(xì)胞穿透力強(qiáng)且高效富集、可控釋放的載藥系統(tǒng)來(lái)提高抗氧化劑治療效果是必要的。碳納米管（Carbon Nanotubes，CN

2、Ts）是由碳原子形成的一維中空管狀體。近年來(lái)，CNTs以其獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)成為納米醫(yī)學(xué)甚至整個(gè)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，尤其是在載藥方面，CNTs更是具有許多獨(dú)特的優(yōu)良性質(zhì)。本研究中，首先通過(guò)研究不同濃度過(guò)氧化氫(H2O2)作用不同時(shí)間對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo氧化損傷水平的影響，確定建立人滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的條件;其次，分別制備了小分子羧基和超氧化物歧化酶(SOD)功能化修飾的多壁碳納米管（MWNT-COOH和SOD-g

3、-MWNT），并對(duì)其物理化學(xué)特性及生物安全性進(jìn)行了表征和研究;最后，在建立的滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo氧化應(yīng)激模型基礎(chǔ)上，比較還原型谷胱甘肽(GSH)、MWNT-COOH+GSH和SOD-g-MWNT+ GSH這三者在提高HTR-8/SVneo細(xì)胞對(duì)氧化損傷的耐受性、改善細(xì)胞氧化損傷中所起的不同作用。旨在尋找一種能夠載送大分子抗氧化劑進(jìn)入細(xì)胞、提高抗氧化劑治療效果同時(shí)減少其副作用的方法。
　　第一部分過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細(xì)胞HT

4、R-8/SVneo氧化應(yīng)激模型的建立
　　目的:通過(guò)研究不同濃度過(guò)氧化氫(H2O2)作用不同時(shí)間對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo氧化應(yīng)激水平的影響，確定建立滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的條件。
　　方法:用不同濃度H2O2分別作用于HTR-8/SVneo不同時(shí)間，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，分光光度法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD活性及LDH含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子含量以及細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:從整體來(lái)看，H2O2

5、引起HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD活性降低，LDH活性增加，細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子水平增高，細(xì)胞凋亡率增加，并且這些作用與H2O2濃度和作用時(shí)間相關(guān);但研究亦發(fā)現(xiàn)125μM H2O2作用一定時(shí)間后反而可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高SOD活性，減少LDH外漏，降低細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子含量以及細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)論:較低濃度H2O2作用條件下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，HTR-8/SVneo細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化天平逐漸偏向抗氧化一邊

6、;較高濃度時(shí)，隨著H2O2濃度增加以及作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞發(fā)生氧化損傷趨于顯著。建立人滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo氧化應(yīng)激模型的合適條件為250μM H2O2作用4小時(shí)。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡所起的作用具有雙向性，其中細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能起到了重要調(diào)節(jié)作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　第二部分制備小分子羧基和SOD修飾的碳納米管并研究其生物安全性
　　目的:制備小分子羧基修飾的多壁碳納米管(MWNT-COO

7、H)及SOD功能化改性的碳納米管(SOD-g-MWNT)，檢測(cè)MWNT-COOH和SOD-g-MWNT的特性，評(píng)價(jià)二者的生物安全性。
　　方法:利用羧基功能化修飾MWNT制備小分子羧基修飾的碳納米管(MWNT-COOH)，共價(jià)連接SOD制備SOD-g-MWNT，透射電鏡及傅立葉紅外光譜分析表征SOD-g-MWNT，熱重分析法(TGA)測(cè)定SOD接枝率，分光光度法檢測(cè)SOD-g-MWNT中SOD活性，CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MWN

8、T-COOH和SOD-g-MWNT對(duì)細(xì)胞的毒性;利用熒光標(biāo)記分子異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記SOD和SOD-g-MWNT，通過(guò)流式熒光定量分析追蹤SOD和SOD-g-MWNT進(jìn)入細(xì)胞的情況。
　　結(jié)果:經(jīng)羧基功能化修飾后，MWNTs長(zhǎng)度大大縮短，并能很好的分散在水溶液中;通過(guò)酰胺鍵可以成功將SOD連接到MWNT-COOH上，接枝率約為11wt％，SOD活性率為82％; FITC-SOD-g-MWNT與細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后的熒光陽(yáng)

9、性率為68.57％，明顯高于FITC-SOD處理組;50μg/ml MWNT-COOH和SOD-g-MWNT作用24小時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖均沒(méi)有影響。
　　結(jié)論:小分子羧基功能化修飾是提高M(jìn)WNT生物相容性及細(xì)胞穿透性的一種有效方法;連接SOD后得到的SOD-g-MWNT不僅沒(méi)有明顯破壞SOD活性，還大大提高了細(xì)胞對(duì)SOD的攝取率;MWNT-COOH和SOD-g-MWNT二者均沒(méi)有表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性。
　　第三部分 MWNT-COO

10、H和SOD-g-MWNT載藥對(duì)GSH抗氧化作用的影響
　　目的:在建立的滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/SVneo氧化應(yīng)激模型基礎(chǔ)上，比較GSH、MWNT-COOH+GSH和SOD-g-MWNT+ GSH這三者在提高HTR-8/SVneo細(xì)胞對(duì)氧化損傷的耐受性、改善細(xì)胞氧化損傷中所起的不同作用。尋找提高抗氧化劑療效、避免其副作用的方法。
　　方法:MWNT-COOH和SOD-g-MWNT作為藥物載體吸附GSH，用GSH、MWNT-COOH

11、+GSH和SOD-g-MWNT+ GSH分別治療H2O2誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化損傷模型，通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)比較三者對(duì)氧化損傷細(xì)胞存活率的影響，通過(guò)流式分析檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較三者對(duì)細(xì)胞氧化損傷的改善作用。
　　結(jié)果:GSH對(duì)HTR-8細(xì)胞氧化損傷有治療作用;MWNT-COOH+GSH對(duì)氧化損傷的治療效果明顯優(yōu)于GSH，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率增加，細(xì)胞內(nèi)ROS生成減少;SOD-g-MWNT+GSH治療組提高細(xì)胞存