慢性乙肝中醫(yī)濕熱中阻、肝郁脾虛、瘀血阻絡(luò)證蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究.pdf

1、目的:利用雙向電泳技術(shù)分離慢性乙型病毒性肝炎(慢性乙肝)中醫(yī)濕熱中阻、肝郁脾虛和瘀血阻絡(luò)三證型患者外周血總蛋白,建立相應(yīng)蛋白質(zhì)圖譜。對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫搜索,比較各證型差異表達(dá)的蛋白質(zhì),初步確定在三個證型中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。通過對差異表達(dá)蛋白質(zhì)與證候關(guān)系的分析,初步探索出慢性乙肝濕熱中阻、肝郁脾虛和瘀血阻絡(luò)證型的蛋白質(zhì)組學(xué)規(guī)律,為中醫(yī)臨床辨識慢性乙肝中醫(yī)證候提供可供參考的客觀化指標(biāo),最終為進(jìn)一步探討慢性乙肝中醫(yī)證候本質(zhì)

2、提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:按照《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》,在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院2008年10月-2009年5月期間慢性乙肝住院病人中收集典型的肝郁脾虛證(4例)、濕熱中阻證(4例)和瘀血阻絡(luò)證(3例)共11例做為觀察組,以健康正常人2例為對照組。通過對雙向電泳技術(shù)中的一些環(huán)節(jié)探索如血漿的提取,上樣量的選擇,電泳參數(shù)的設(shè)置,凝膠的濃度和染色方法的改進(jìn),在PH4-7的IPG凝膠干膠條,以約130μg的上樣量,75000v.h的

3、電泳條件下,初步建立了慢性乙肝血漿的雙向電泳體系。并且得到了分辨率好的差異蛋白表達(dá)圖譜。掃描凝膠成像,以ImageMaster2D軟件分析肝郁脾虛組、濕熱中阻組、瘀血阻絡(luò)組與健康人對照組血漿表達(dá)圖譜。實(shí)驗組與對照組標(biāo)準(zhǔn)化總灰度值(％Vol)相差達(dá)2倍以上的蛋白斑點(diǎn)視為差異表達(dá)蛋白點(diǎn),切取相應(yīng)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn),進(jìn)行基質(zhì)輔助的激光解析飛行時間質(zhì)譜(MADLDI-TOF-MS)檢測,結(jié)合2-DE圖譜中各蛋白質(zhì)點(diǎn)的相對等電點(diǎn)(pI)、相對分子

4、量(Mw)與Swiss-prot蛋白數(shù)據(jù)庫的匹配檢索,鑒定出各差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果:(1)獲得了分辨率和重復(fù)性均較好的慢性乙肝病濕熱中阻組、肝郁脾虛組、瘀血阻絡(luò)組及健康人對照組血漿蛋白質(zhì)組表達(dá)雙向電泳銀染圖譜。健康人平均蛋白點(diǎn)數(shù)為(290±17)個,CHB濕熱中阻證(350±23)個,CHB肝郁脾虛證(328±14)個,CHB瘀血阻絡(luò)證(489±25)個。(2)差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定,共發(fā)現(xiàn)10種蛋白。其功能涉及免疫,脂類

5、代謝,炎癥反應(yīng)等。與正常人比較,在濕熱中阻證有5個蛋白表達(dá)下調(diào),5個蛋白表達(dá)上調(diào)；在肝郁脾虛證有4個蛋白表達(dá)下調(diào),6個蛋白表達(dá)上調(diào)；在瘀血阻絡(luò)證型有4個蛋白表達(dá)下調(diào),6個蛋白表達(dá)上調(diào)。這些蛋白點(diǎn)中表達(dá)上調(diào)的有血清淀粉蛋白P(SAMP)、免疫球蛋白J鏈(IGJ)、C反應(yīng)蛋白(CRP),表達(dá)下調(diào)的有結(jié)合珠蛋白(Hp),前白蛋白,載脂蛋白C(apoC)等。
　　 結(jié)論:(1)初步建立慢性乙肝肝郁脾虛組、濕熱中阻組、瘀血阻絡(luò)組及健康人對

6、照組血漿蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜。(2)慢性乙肝肝郁脾虛證組、濕熱中阻證組、瘀血阻絡(luò)證組和健康對照組存在多個蛋白質(zhì)表達(dá)差異,表明CHB存在多蛋白表達(dá)異常。慢性乙肝不同證型間存在多個差異表達(dá)蛋白提示同病異證具有不同的物質(zhì)基礎(chǔ)(不同的蛋白質(zhì)),此為中醫(yī)“證”本質(zhì)研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。(3)在濕熱中阻證中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要屬于急性時相蛋白和脂類代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)。其中載脂蛋白C的表達(dá)升高可能與此證型中細(xì)胞膜損害明顯而改變其結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)。(4)肝郁脾虛證