慢性腎小球腎炎病證結(jié)合唾液蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、目的:應用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)，選擇西醫(yī)確診慢性腎小球腎炎（CGN）患者，根據(jù)病證結(jié)合分組，并與體檢正常的健康人群對照，進行唾液蛋白質(zhì)組學研究，初步建立慢性腎小球腎炎腎虛證的診斷模型；并從蛋白質(zhì)組水平初步探討中醫(yī)同病異證的現(xiàn)代科學基礎(chǔ)；建立具有中醫(yī)特色無創(chuàng)傷的唾液蛋白質(zhì)組診斷技術(shù)，進一步推動微觀辨證學的發(fā)展和促進中醫(yī)診斷學的現(xiàn)代化。
　　方法:采集88例唾液標本，其中正常對照者45例均為

2、健康體檢正常者。所有疾病患者均經(jīng)過腎活檢病理檢查明確診斷。按病證結(jié)合分為以下兩大組：（1）慢性腎小球腎炎與正常組：比較慢性腎小球腎炎患者與正常對照者蛋白質(zhì)表達譜的差異。（2）中醫(yī)同病異證分組：即以證候為綱進行分組，全部病例按中醫(yī)虛證辨證標準分為脾虛、腎虛、脾腎兩虛和非脾腎虛4組，與正常組對照進行研究。采用液態(tài)芯片（WCX磁珠）制備唾液樣品，結(jié)合MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀對所有慢性腎小球腎炎患者和正常對照組的唾液進行蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測。

3、設(shè)定所有唾液樣本檢測的蛋白質(zhì)采集分子量相對范圍為2000~25000Da，對每個組合內(nèi)的相同質(zhì)荷比不同含量的蛋白進行分析比較，找到組合內(nèi)蛋白含量有顯著差異的質(zhì)荷比峰。所得到蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比峰值用Biomarker Wizard3.0軟件過濾噪音，將軟件處理后的蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰強度值資料導入Biomarker Pattern Software5.0.2，采用決策樹算法，確定最佳的篩選模型。選出組合內(nèi)含量有顯著差異的蛋白質(zhì)波峰初步建立相應疾病、證

4、候及病證結(jié)合的唾液蛋白質(zhì)組診斷模型。將全部標本用隨機數(shù)字表法分為學習訓練組和驗證組，用所建立的診斷模型分別在學習模式和測試模式下對樣本進行分類診斷，對測試組標本在測試模式下進行雙盲檢測，驗證和評估所建立診斷模型的敏感性、特異性和準確性，綜合評價其診斷效率。
　　結(jié)果:（1）按西醫(yī)疾病分組：正常對照組與慢性腎小球腎炎組兩組樣本共88例，對所有的樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，兩個組共得到蛋白質(zhì)峰為410個，其中224個統(tǒng)計差異顯著的蛋白

5、峰，選擇質(zhì)荷比（m/z）為7101.90Da和2616.91Da兩個蛋白質(zhì)峰進行建模，識別率為93.02％，預測能力91.11%。臨床回代檢驗結(jié)果，43例慢性腎小球腎炎患者中有35例被準確檢出為慢性腎小球腎炎，45例正常組中有36例被準確檢出為非慢性腎小球腎炎。結(jié)果表明，該診斷模型的準確率為80.68%（71/88），靈敏度為81.40%（35/43），特異度為80.00%（36/45）。（2）按中醫(yī)同病異證分組：將慢性腎小球腎炎患者按

6、照中醫(yī)虛證診斷標準分為脾虛、腎虛、脾腎兩虛3組，和45例正常對照組共81例。①虛證組與正常組對比：1）將脾虛組和正常對照組的唾液樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，得到具有統(tǒng)計差異的蛋白質(zhì)峰共155個，通過遺傳算法找到3個差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）分別為：7101.905Da、3641.061Da、3931.962Da；2）分析比較腎虛組和正常對照組的唾液樣本檢測質(zhì)譜圖，共得到227個具有統(tǒng)計差異的蛋白質(zhì)峰。通過遺傳算法找到腎虛患者有3

7、個蛋白質(zhì)峰，質(zhì)荷比（m/z）分別為：2431.669Da、4660.730Da、7101.905Da顯著高于正常人，建立診斷模型，識別率為90.00%，預測能力97.78%。臨床回代檢驗結(jié)果，21例慢性腎小球腎炎腎虛證患者中有18例被準確檢出為腎虛證，45例正常組中有42例被準確檢出為非腎虛證。該診斷模型的準確率為90.91%（60/66），靈敏度為85.71%（18/21），特異度為93.33%（42/45）；3）分析對比脾腎兩虛組和

8、正常對照組的唾液樣本檢測質(zhì)譜圖，共得到具有統(tǒng)計差異的蛋白質(zhì)峰103個，通過遺傳算法找到2個差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）分別為：7101.905Da、2616.913Da。②虛證組組間對比：1）對脾虛組和腎虛組樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，共得到具有統(tǒng)計差異的蛋白質(zhì)峰35個，通過遺傳算法找到1個差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）：2952.974Da；2）對脾虛組和脾腎兩虛組樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，共得到具有統(tǒng)計差異的蛋白質(zhì)峰32

9、個，通過遺傳算法找到1個差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）：2102.998Da；3）對腎虛組和脾腎兩虛組樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，共得到具有統(tǒng)計差異的蛋白質(zhì)峰12個，通過遺傳算法找到1個差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）：3872.561Da。
　　結(jié)論:本研究運用液態(tài)芯片結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)對慢性腎小球腎炎患者與正常對照組的睡液蛋白質(zhì)進行表達譜檢測，從唾液蛋白質(zhì)組初步篩選出可用于慢性腎小球腎炎病證結(jié)合診斷的具有特