慢乙肝肝腎陰虛證與瘀血阻絡(luò)證相關(guān)分子機(jī)理研究.pdf

1、目的：研究慢乙肝肝腎陰虛證、瘀血阻絡(luò)證患者的白細(xì)胞基因表達(dá)譜及HBV前C區(qū)變異情況與相應(yīng)證候之間的相關(guān)機(jī)制。 方法：1.參照《1995年第五次全國(guó)傳染病寄生蟲(chóng)病學(xué)術(shù)會(huì)議討論修訂，病毒性肝炎防治方案(試行)》(中華內(nèi)科雜志，1995，(11)：788～791)為納入及排除標(biāo)準(zhǔn)；《中國(guó)中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肝病專(zhuān)委會(huì)，病毒性肝炎中醫(yī)辯證標(biāo)準(zhǔn)(試行)》為辨證標(biāo)準(zhǔn)，分別于臨床選取辨證符合肝腎陰虛證患者34人，以及瘀血阻絡(luò)證患者40人。 2.

2、抽取患者靜脈血，分離血清，提取HBV-DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，與乙型肝炎病毒前C區(qū)變異基因芯片雜交，將雜交后晾干之芯片用GenePixPersonal4100A基因芯片掃描儀掃描.掃描圖像用Imagene圖像分析軟件掃描結(jié)果進(jìn)行定量分析。依據(jù)乙型肝炎病毒前C區(qū)變異基因芯片檢測(cè)結(jié)果計(jì)算機(jī)自動(dòng)進(jìn)行結(jié)果判定。包括乙肝病毒前C區(qū)變異基因1896、1899、1862、1764、1762位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果。計(jì)算各證型不同位點(diǎn)變異率(％)和不同位點(diǎn)野生株

3、、變異株信號(hào)強(qiáng)度。所得數(shù)據(jù)中率的比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。 3.在兩證型患者中各隨機(jī)選取一人，抽取靜脈血，分離白細(xì)胞，TRIzol法抽提總RNA，線性放大RNA后，用反轉(zhuǎn)cDNA第一鏈標(biāo)記制備熒光探針，并以QIAquickNucleotideRemovalKit純化熒光探針，將純化好的探針轉(zhuǎn)入酶標(biāo)板，分別測(cè)定A260、A550、A650后，芯片雜交完成后，采用Genespring進(jìn)行Normalize處理分析，最后r

4、atio值為cy3/cy5(實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為ratio≥2為上調(diào)基因，ratio≤0.5為下調(diào)基因。所得數(shù)據(jù)用MicrosoftAccess、MicrosoftExcel軟件處理。 結(jié)果：1.HBV前C區(qū)檢測(cè)結(jié)果：HBV前C區(qū)變異率1762位點(diǎn)：肝腎陰虛證32.35％，瘀血阻絡(luò)證92.5％，兩證之間有顯著性差異，P＜0.001；1764位點(diǎn)：肝腎陰虛證38.24％，瘀血阻絡(luò)證90％，兩證之間有顯著性差異，P＜

5、0.001；1896位點(diǎn)：肝腎陰虛證67.65％，瘀血阻絡(luò)證30％。兩證之間有顯著性差異，P＜0.001。變異株信號(hào)強(qiáng)度：1762、1764、1899位點(diǎn)：瘀血阻絡(luò)＞肝腎陰虛；1896位點(diǎn)：肝腎陰虛＞瘀血阻絡(luò)。 2.白細(xì)胞基因表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果：肝腎陰虛證：上調(diào)397條，下調(diào)628條。瘀血阻絡(luò)證：上調(diào)435條，下調(diào)530條。兩證型涉及生物學(xué)過(guò)程廣泛，與細(xì)胞周期和免疫學(xué)相關(guān)有：NF-kappaB誘導(dǎo)激酶，CDK活動(dòng)調(diào)節(jié)，RAS蛋白信號(hào)

6、轉(zhuǎn)導(dǎo)，RhoGTP酶激活子，MAPK通路，胰島素樣生長(zhǎng)因子，JNK信號(hào)級(jí)連，整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路，TNF與TNF受體活動(dòng)，TGFβ受體，干擾素γ，白介素-1、-6、-10、-12，NO生物合成，前列腺素D2生物合成、白三烯B4生物合成與代謝等。 結(jié)論：1.HBV前C區(qū)突變與肝腎陰虛證和瘀血阻絡(luò)證有一定相關(guān)。2.慢乙肝肝腎陰虛證和瘀血阻絡(luò)證患者的白細(xì)胞基因表達(dá)譜與正常人不同.3.肝腎陰虛證和瘀血阻絡(luò)證患者白細(xì)胞基因表達(dá)譜兩證型間存