微小RNA(microRNA)以及RNA結(jié)合蛋白對參與心肌重構(gòu)重要基因調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　 體內(nèi)自然存在的微小RNA(miRNA)是小的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的非編碼RNA,它能夠通過影響翻譯或者靶。mRNA穩(wěn)定性從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA參與多種基本生物學(xué)過程,如細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡、病毒感染和癌癥等。在生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。將是繼siRNA之后新的研究熱點(diǎn)之一。超過三分之一的人類基因都受miRNA的控制。
　　 由于miRNA天然存在于動(dòng)植物體內(nèi),探索miRNA對腫瘤抑制基因和疾病相關(guān)基

2、因的作用無疑將會(huì)揭開這些疾病治療的新篇章。目前只有少數(shù)miRNA的部分功能和靶點(diǎn)被鑒定。組織金屬蛋白酶抑制因子3基因和miR-1,miR-21(microRNA-21)均在心血管紊亂疾病和癌癥中異常表達(dá)。miR-1廣泛分布于心肌,骨骼肌。TIMP3(組織金屬蛋白酶抑制因子3基因)在心臟中大量存在,在缺陷的心臟中表達(dá)下調(diào)。冠狀動(dòng)脈硬化的個(gè)體內(nèi)miR-1過度表達(dá)。在正常或心肌梗塞的大鼠心臟里過表達(dá)miR-1會(huì)加速心律不齊。用反義的抑制劑除去

3、心肌梗塞大鼠心臟內(nèi)過表達(dá)的miR-1會(huì)減輕這種癥狀。miR-1表達(dá)低于正常水平可引起心肌肥大。miRNAs的失調(diào)成為心臟病的起因之一。未來的任務(wù)是確認(rèn)這些失調(diào)miRNA的靶mRNA因?yàn)閙iRNA通常有許多個(gè)靶mRNAs,每個(gè)miRNA對心肌生長和功能的作用反映了許多mRNA表達(dá)的改變。進(jìn)一步分析這些miRNA的靶mRNA會(huì)為心血管疾病提供新的診斷,預(yù)后和治療靶標(biāo)。
　　 心力衰竭高發(fā)病率、患病率和死亡率已經(jīng)成為21世紀(jì)發(fā)達(dá)和發(fā)展

4、中國家的重要公共衛(wèi)生問題。目前的心衰治療方案均有一定的副作用,因此繼續(xù)研究疾病的基本病因以便選擇特異性的對因治療方案和靶點(diǎn)具有特殊的重要性和迫切性。幾個(gè)不同的研究小組發(fā)現(xiàn)miR-21在心肌肥厚模型中表達(dá)持續(xù)增高。而且用反義核苷酸敲減miR-21的表達(dá)可以抑制心肌細(xì)胞肥大的表型。miRNA-21在心力衰竭模型鼠的成纖維細(xì)胞內(nèi)大大增加。很重要的是,心力衰竭患者心肌亦有同樣結(jié)果。心肌重構(gòu)在心衰進(jìn)展中起重要作用,目前尚未有人證明miR-21在心

5、肌細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)參與心肌重構(gòu)通路基因的表達(dá)。正常情況下,MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)和TIMPs(組織金屬蛋白酶抑制劑)之間處于平衡狀態(tài)。MMPs和TIMPs的失衡與心室擴(kuò)張和重構(gòu)有關(guān),并將最終導(dǎo)致心力衰竭。終末期心衰患者心室肌中TIMP-3減少程度與心室基質(zhì)重構(gòu)程度平行。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道MMPs和ADAMs(分離整和素金屬蛋白酶)的有力抑制劑TIMP-3將會(huì)是一個(gè)很有希望的治療靶點(diǎn)。近年來的研究已經(jīng)明確導(dǎo)致心衰發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制是心肌重構(gòu),慢性心

6、力衰竭治療的關(guān)鍵還是逆轉(zhuǎn)或者延緩心肌重構(gòu)。心肌成纖維細(xì)胞分泌的MMPs/TIMPs(組織基質(zhì)金屬蛋白酶/組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑)的平衡在心室重構(gòu)中起著十分重要的作用,因而成為心力衰竭治療的一個(gè)新靶標(biāo)。臨床上已經(jīng)開始應(yīng)用多種藥物增加組織金屬蛋白酶抑制因子3基因表達(dá)減少M(fèi)MPs水平來改善心室重構(gòu)。基于這些研究基礎(chǔ),本課題以在心力衰竭中異常表達(dá)的miR-21為靶點(diǎn)的反義核苷酸(antagomiR-21)對心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)的TIMP3/MM

7、Ps進(jìn)行調(diào)控,從而達(dá)到改善心肌重構(gòu),避免心臟纖維化,治療心力衰竭的目的。本項(xiàng)目證明miR-21參與調(diào)控心肌重構(gòu)重要基因,miR-21調(diào)控組織金屬蛋白酶抑制因子3基因,MMP9在心肌細(xì)胞內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道。從而根據(jù)調(diào)控通路推斷miR-21反義核苷酸同時(shí)可以抑制MMPs等參與心肌重構(gòu)的重要基因在心力衰竭中的異常表達(dá)。進(jìn)而可能抑制心力衰竭。
　　 真核生物mRNA 3’非翻譯區(qū)可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位和翻譯水平,決定某一特定mR

8、NA的命運(yùn),是許多基因表達(dá)所必需的一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)。3’非翻譯區(qū)介導(dǎo)的功能的修飾可影響一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá),從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。對相關(guān)mRNA 3’非翻譯區(qū)的調(diào)節(jié)序列和與這些序列特異結(jié)合的蛋白質(zhì)等具體信息的認(rèn)識,將成為藥物設(shè)計(jì)的新的分子靶。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、Targetscan,pictar等生物信息學(xué)工具預(yù)測表明,hsa-miR-1,hsa-miR-20a,hsa-miR-106b,hsa-miR-30e-5p,h

9、sa-miR-206,hsa-miR-144,hsa-miR-181,hsa-miR-30d,hsa-miR-221,hsa-miR-21,hsa-miR-30b,hsa-miR-101,hsa-miR-22等均可能以組織金屬蛋白酶抑制因子3基因?yàn)榘谢?其中miR-1最為可能,因?yàn)樗辉S多miRNA預(yù)測程序列為前三個(gè)最有可能以組織金屬蛋白酶抑制因子3基因?yàn)榘谢虻膍iRNA。
　　 2、Western blot證實(shí)has-mi

10、R-1(人microR-NA-1)下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因蛋白表達(dá)水平。
　　 3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR證明相對于陰性轉(zhuǎn)染對照組,hsa-miR-1下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因mRNA水平。
　　 4、應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測hsa-miR-1在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因基因中的靶點(diǎn),PCR技術(shù)擴(kuò)增niR-1預(yù)測靶點(diǎn)附近組織金屬蛋白酶抑制因子3基因,克隆入熒光素酶表達(dá)載體pGL3構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-TIMP3

11、,并用定點(diǎn)突變技術(shù)成功構(gòu)建突變載體,電泳鑒定重組質(zhì)粒表達(dá)及測序驗(yàn)證；
　　 5、hsa-miK-1野生型與突變型載體與renilla和hsa-miR-1共轉(zhuǎn)染粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了hsa-miR-1在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因內(nèi)的第一個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)為ACATTCCA。hsa-miR-1對組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的調(diào)控是直接的。從而確定了參與組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的順式調(diào)控序列。用克隆,定點(diǎn)突變和雙亮熒光酶

12、測定技術(shù)證實(shí)了hsa-miR-1直接打靶組織金屬蛋白酶抑制因子3基因基因,在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因3’非翻譯區(qū)內(nèi)存在靶點(diǎn)。對于hsa-miR-1在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因內(nèi)的第一個(gè)預(yù)測靶點(diǎn),突變型載體的熒光強(qiáng)度以海。腎熒光素酶的熒光強(qiáng)度作內(nèi)參優(yōu)化后,明顯高于野生型。T-test統(tǒng)計(jì)分析具有顯著性p<0.001。而miRNA前體陰性對照轉(zhuǎn)染組野生型和突變型的熒光素酶的活力以海參熒光素酶作內(nèi)參優(yōu)化后則呈不規(guī)則變化。對于miR-1在

13、組織金屬蛋白酶抑制因子3基因內(nèi)的第二個(gè)預(yù)測靶點(diǎn),在突變四個(gè)堿基的情況下,這種變化不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、通過轉(zhuǎn)染和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-21可以下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因,增加MMP9的表達(dá),同時(shí)證明了antagomiR-21可以增加TIMP3降低MMP9的表達(dá)。TIMP3在心肌肥大和心力衰竭中表達(dá)降低,而miR-21在這些心血管疾病中異常升高。TIMP3和MMP9是參與心肌重構(gòu)的重要分子。而心力衰

14、竭的基礎(chǔ)就是心肌重構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了通過抑制miR-21在心肌肥大和心力衰竭中的異常表達(dá),有望調(diào)控心肌重構(gòu)途徑。通過此試驗(yàn)證明了TIMP3受另外一個(gè)反式作用因子miR-21的調(diào)節(jié)。
　　 7、通過IP和-RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)HuR蛋白質(zhì)結(jié)合組織金屬蛋白酶抑制因子3基因3’未翻譯區(qū),通過siRNA knock down HuR從而下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因mRNA水平證實(shí)HuR參與組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。其

15、可能結(jié)合的區(qū)域由生物信息學(xué)方法預(yù)測。通過此試驗(yàn)證明了組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的另外一個(gè)反式作用因子:ARE結(jié)合蛋白HuR。
　　 結(jié) 論
　　 實(shí)驗(yàn)證明了在HEK293細(xì)胞內(nèi)hsa-miR-1直接調(diào)控腫瘤抑制基因組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。下調(diào)其mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因3’未翻譯區(qū)內(nèi)存在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的靶點(diǎn)。hsa-miR-1通過組織金屬蛋白酶抑制因子3基因

16、3’UTR調(diào)節(jié)的順式作用元件得以確定。通過IP和RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)ARE結(jié)合蛋白HuR結(jié)合組織金屬蛋白酶抑制因子3基因3’未翻譯區(qū),通過siRNA敲減HuR基因表達(dá)從而下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因mRNA水平證實(shí)HuR參與組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。從而確定了HuR為參與組織金屬蛋白酶抑制因子3基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的反式作用元件。通過轉(zhuǎn)染和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-21可以下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因,增加M

17、MP9的表達(dá),同時(shí)證明了antagomiR-21可以增加組織金屬蛋白酶抑制因子3基因降低MMP9的表達(dá)。通過此試驗(yàn)證明了組織金屬蛋白酶抑制因子3基因受另外一個(gè)反式作用元件miR-21的調(diào)節(jié)。
　　 組織金屬蛋白酶抑制因子3基因和hsa-miR-1在關(guān)節(jié)炎,癌癥,以及心臟病中均異常表達(dá),這為探索其致病機(jī)理,以及基因治療這些疾病提供了線索。組織金屬蛋白酶抑制因子3基因在心肌肥大和心力衰竭中表達(dá)降低,而miR-21在這些心血管疾病中異

18、常升高。TIMP3和MMP9是參與心肌重構(gòu)的重要分子。而心力衰竭的基礎(chǔ)就是心肌重構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了通過抑制miR-21在心肌肥大和心力衰竭中的異常表達(dá),有望調(diào)控心肌重構(gòu)途徑。由于miR-21在多種癌癥中表達(dá)上調(diào),而組織金屬蛋白酶抑制因子3基因在這些癌癥中表達(dá)沉默。以往的觀點(diǎn)認(rèn)為這可能是由于組織金屬蛋白酶抑制因子3基因啟動(dòng)子甲基化引起,但是并非所有癌癥都發(fā)現(xiàn)了組織金屬蛋白酶抑制因子3基因啟動(dòng)子的甲基化,我們的研究為合理解釋這一現(xiàn)象提供了開