微小RNA(microRNA)以及RNA結(jié)合蛋白對參與心肌重構(gòu)重要基因調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、實驗目的
　　 體內(nèi)自然存在的微小RNA(miRNA)是小的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的非編碼RNA,它能夠通過影響翻譯或者靶。mRNA穩(wěn)定性從而調(diào)節(jié)基因表達。miRNA參與多種基本生物學過程,如細胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡、病毒感染和癌癥等。在生命活動中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。將是繼siRNA之后新的研究熱點之一。超過三分之一的人類基因都受miRNA的控制。
　　 由于miRNA天然存在于動植物體內(nèi),探索miRNA對腫瘤抑制基因和疾病相關基

2、因的作用無疑將會揭開這些疾病治療的新篇章。目前只有少數(shù)miRNA的部分功能和靶點被鑒定。組織金屬蛋白酶抑制因子3基因和miR-1,miR-21(microRNA-21)均在心血管紊亂疾病和癌癥中異常表達。miR-1廣泛分布于心肌,骨骼肌。TIMP3(組織金屬蛋白酶抑制因子3基因)在心臟中大量存在,在缺陷的心臟中表達下調(diào)。冠狀動脈硬化的個體內(nèi)miR-1過度表達。在正常或心肌梗塞的大鼠心臟里過表達miR-1會加速心律不齊。用反義的抑制劑除去

3、心肌梗塞大鼠心臟內(nèi)過表達的miR-1會減輕這種癥狀。miR-1表達低于正常水平可引起心肌肥大。miRNAs的失調(diào)成為心臟病的起因之一。未來的任務是確認這些失調(diào)miRNA的靶mRNA因為miRNA通常有許多個靶mRNAs,每個miRNA對心肌生長和功能的作用反映了許多mRNA表達的改變。進一步分析這些miRNA的靶mRNA會為心血管疾病提供新的診斷,預后和治療靶標。
　　 心力衰竭高發(fā)病率、患病率和死亡率已經(jīng)成為21世紀發(fā)達和發(fā)展

4、中國家的重要公共衛(wèi)生問題。目前的心衰治療方案均有一定的副作用,因此繼續(xù)研究疾病的基本病因以便選擇特異性的對因治療方案和靶點具有特殊的重要性和迫切性。幾個不同的研究小組發(fā)現(xiàn)miR-21在心肌肥厚模型中表達持續(xù)增高。而且用反義核苷酸敲減miR-21的表達可以抑制心肌細胞肥大的表型。miRNA-21在心力衰竭模型鼠的成纖維細胞內(nèi)大大增加。很重要的是,心力衰竭患者心肌亦有同樣結(jié)果。心肌重構(gòu)在心衰進展中起重要作用,目前尚未有人證明miR-21在心

5、肌細胞內(nèi)調(diào)節(jié)參與心肌重構(gòu)通路基因的表達。正常情況下,MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)和TIMPs(組織金屬蛋白酶抑制劑)之間處于平衡狀態(tài)。MMPs和TIMPs的失衡與心室擴張和重構(gòu)有關,并將最終導致心力衰竭。終末期心衰患者心室肌中TIMP-3減少程度與心室基質(zhì)重構(gòu)程度平行。據(jù)文獻報道MMPs和ADAMs(分離整和素金屬蛋白酶)的有力抑制劑TIMP-3將會是一個很有希望的治療靶點。近年來的研究已經(jīng)明確導致心衰發(fā)生發(fā)展的基本機制是心肌重構(gòu),慢性心

6、力衰竭治療的關鍵還是逆轉(zhuǎn)或者延緩心肌重構(gòu)。心肌成纖維細胞分泌的MMPs/TIMPs(組織基質(zhì)金屬蛋白酶/組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑)的平衡在心室重構(gòu)中起著十分重要的作用,因而成為心力衰竭治療的一個新靶標。臨床上已經(jīng)開始應用多種藥物增加組織金屬蛋白酶抑制因子3基因表達減少MMPs水平來改善心室重構(gòu)。基于這些研究基礎,本課題以在心力衰竭中異常表達的miR-21為靶點的反義核苷酸(antagomiR-21)對心肌成纖維細胞表達的TIMP3/MM

7、Ps進行調(diào)控,從而達到改善心肌重構(gòu),避免心臟纖維化,治療心力衰竭的目的。本項目證明miR-21參與調(diào)控心肌重構(gòu)重要基因,miR-21調(diào)控組織金屬蛋白酶抑制因子3基因,MMP9在心肌細胞內(nèi)未見相關報道。從而根據(jù)調(diào)控通路推斷miR-21反義核苷酸同時可以抑制MMPs等參與心肌重構(gòu)的重要基因在心力衰竭中的異常表達。進而可能抑制心力衰竭。
　　 真核生物mRNA 3’非翻譯區(qū)可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性、亞細胞定位和翻譯水平,決定某一特定mR

8、NA的命運,是許多基因表達所必需的一個調(diào)節(jié)區(qū)。3’非翻譯區(qū)介導的功能的修飾可影響一個或多個基因的表達,從而導致疾病的發(fā)生。對相關mRNA 3’非翻譯區(qū)的調(diào)節(jié)序列和與這些序列特異結(jié)合的蛋白質(zhì)等具體信息的認識,將成為藥物設計的新的分子靶。
　　 實驗結(jié)果
　　 1、Targetscan,pictar等生物信息學工具預測表明,hsa-miR-1,hsa-miR-20a,hsa-miR-106b,hsa-miR-30e-5p,h

9、sa-miR-206,hsa-miR-144,hsa-miR-181,hsa-miR-30d,hsa-miR-221,hsa-miR-21,hsa-miR-30b,hsa-miR-101,hsa-miR-22等均可能以組織金屬蛋白酶抑制因子3基因為靶基因,其中miR-1最為可能,因為它被許多miRNA預測程序列為前三個最有可能以組織金屬蛋白酶抑制因子3基因為靶基因的miRNA。
　　 2、Western blot證實has-mi

10、R-1(人microR-NA-1)下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因蛋白表達水平。
　　 3、實時熒光定量PCR證明相對于陰性轉(zhuǎn)染對照組,hsa-miR-1下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因mRNA水平。
　　 4、應用生物信息學技術預測hsa-miR-1在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因基因中的靶點,PCR技術擴增niR-1預測靶點附近組織金屬蛋白酶抑制因子3基因,克隆入熒光素酶表達載體pGL3構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-TIMP3

11、,并用定點突變技術成功構(gòu)建突變載體,電泳鑒定重組質(zhì)粒表達及測序驗證；
　　 5、hsa-miK-1野生型與突變型載體與renilla和hsa-miR-1共轉(zhuǎn)染粒轉(zhuǎn)染293細胞,雙熒光素酶實驗證實了hsa-miR-1在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因內(nèi)的第一個預測靶點為ACATTCCA。hsa-miR-1對組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的調(diào)控是直接的。從而確定了參與組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的順式調(diào)控序列。用克隆,定點突變和雙亮熒光酶

12、測定技術證實了hsa-miR-1直接打靶組織金屬蛋白酶抑制因子3基因基因,在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因3’非翻譯區(qū)內(nèi)存在靶點。對于hsa-miR-1在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因內(nèi)的第一個預測靶點,突變型載體的熒光強度以海。腎熒光素酶的熒光強度作內(nèi)參優(yōu)化后,明顯高于野生型。T-test統(tǒng)計分析具有顯著性p<0.001。而miRNA前體陰性對照轉(zhuǎn)染組野生型和突變型的熒光素酶的活力以海參熒光素酶作內(nèi)參優(yōu)化后則呈不規(guī)則變化。對于miR-1在

13、組織金屬蛋白酶抑制因子3基因內(nèi)的第二個預測靶點,在突變四個堿基的情況下,這種變化不明顯,無統(tǒng)計學意義。
　　 6、通過轉(zhuǎn)染和實時熒光定量PCR實驗證實了miR-21可以下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因,增加MMP9的表達,同時證明了antagomiR-21可以增加TIMP3降低MMP9的表達。TIMP3在心肌肥大和心力衰竭中表達降低,而miR-21在這些心血管疾病中異常升高。TIMP3和MMP9是參與心肌重構(gòu)的重要分子。而心力衰

14、竭的基礎就是心肌重構(gòu)。實驗結(jié)果提示了通過抑制miR-21在心肌肥大和心力衰竭中的異常表達,有望調(diào)控心肌重構(gòu)途徑。通過此試驗證明了TIMP3受另外一個反式作用因子miR-21的調(diào)節(jié)。
　　 7、通過IP和-RT-PCR實驗證實HuR蛋白質(zhì)結(jié)合組織金屬蛋白酶抑制因子3基因3’未翻譯區(qū),通過siRNA knock down HuR從而下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因mRNA水平證實HuR參與組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。其

15、可能結(jié)合的區(qū)域由生物信息學方法預測。通過此試驗證明了組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的另外一個反式作用因子:ARE結(jié)合蛋白HuR。
　　 結(jié) 論
　　 實驗證明了在HEK293細胞內(nèi)hsa-miR-1直接調(diào)控腫瘤抑制基因組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。下調(diào)其mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因3’未翻譯區(qū)內(nèi)存在組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的靶點。hsa-miR-1通過組織金屬蛋白酶抑制因子3基因

16、3’UTR調(diào)節(jié)的順式作用元件得以確定。通過IP和RT-PCR實驗證實ARE結(jié)合蛋白HuR結(jié)合組織金屬蛋白酶抑制因子3基因3’未翻譯區(qū),通過siRNA敲減HuR基因表達從而下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因mRNA水平證實HuR參與組織金屬蛋白酶抑制因子3基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。從而確定了HuR為參與組織金屬蛋白酶抑制因子3基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的反式作用元件。通過轉(zhuǎn)染和實時熒光定量PCR實驗證實了miR-21可以下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制因子3基因,增加M

17、MP9的表達,同時證明了antagomiR-21可以增加組織金屬蛋白酶抑制因子3基因降低MMP9的表達。通過此試驗證明了組織金屬蛋白酶抑制因子3基因受另外一個反式作用元件miR-21的調(diào)節(jié)。
　　 組織金屬蛋白酶抑制因子3基因和hsa-miR-1在關節(jié)炎,癌癥,以及心臟病中均異常表達,這為探索其致病機理,以及基因治療這些疾病提供了線索。組織金屬蛋白酶抑制因子3基因在心肌肥大和心力衰竭中表達降低,而miR-21在這些心血管疾病中異

18、常升高。TIMP3和MMP9是參與心肌重構(gòu)的重要分子。而心力衰竭的基礎就是心肌重構(gòu)。實驗結(jié)果提示了通過抑制miR-21在心肌肥大和心力衰竭中的異常表達,有望調(diào)控心肌重構(gòu)途徑。由于miR-21在多種癌癥中表達上調(diào),而組織金屬蛋白酶抑制因子3基因在這些癌癥中表達沉默。以往的觀點認為這可能是由于組織金屬蛋白酶抑制因子3基因啟動子甲基化引起,但是并非所有癌癥都發(fā)現(xiàn)了組織金屬蛋白酶抑制因子3基因啟動子的甲基化,我們的研究為合理解釋這一現(xiàn)象提供了開