微小RNA-16(microRNA-16)下調(diào)表達在心肌肥厚中的作用機制研究.pdf

1、心肌肥厚是一種常見的心血管疾病,是心肌重構(gòu)中非常重要的方面,晚期的結(jié)局往往會引發(fā)心力衰竭或猝死。心肌肥厚分子機制相當復雜,現(xiàn)已證實心肌肥厚的發(fā)生與細胞周期調(diào)控,鈣信號調(diào)控等多種信號途徑相關,全面揭示心肌肥厚發(fā)生的分子機制對于治療心肌肥厚尤為重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性小片段非編碼RNA,可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達,參與細胞的生長、發(fā)育、分化和多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。多個研究證實,miRNAs參與了心肌肥

2、厚的發(fā)生過程。
　　微小RNA-16(miR-16)是腫瘤學研究的熱點之一。據(jù)報道,在慢性淋巴細胞白血病患者中miR-16表達下調(diào),恢復miR-16表達可起到抑制腫瘤的作用。miR-16是心肌組織中中等豐度表達的miRNA,其在心肌肥厚中的作用尚無報道。擬通過腹主動脈縮窄(AAC)手術(shù),制備大鼠心肌肥厚模型,研究miR-16在發(fā)生肥厚的大鼠心肌中的表達和在心肌肥厚中的調(diào)控作用,并進一步明確調(diào)控miR-16表達的信號轉(zhuǎn)導通路。

3、>　　已有研究顯示,細胞周期素(Cyclin)在心肌肥厚時表達增強,推動細胞周期由G1向S期轉(zhuǎn)化,進而促進心肌細胞肥大。我們發(fā)現(xiàn),miR-16在心肌肥厚時表達下調(diào),生物信息學分析提示,CyclinD1、CyclinD2和CyclinE1基因的3’UTR存在miR-16潛在的作用位點。本文提出以下科學假設:miR-16下調(diào)可促進CyclinD1、CyclinD2和CyclinE1表達,推動細胞周期由G1向S期轉(zhuǎn)化,進而促進心肌細胞肥大。<

4、br>　　第一部分：大鼠腹主動脈縮窄(AAC)致心肌肥厚模型的制備和鑒定
　　目的：建立因后負荷增加引起的大鼠心肌肥厚模型。方法：選用SD大鼠,體重約220g~250g,隨機分四組,即假手術(shù)組(Sham)、模型AAC1周(AAC-1w)、AAC2周(AAC-2w)、AAC3周(AAC-3w),每組8只。模型組采用0.3mm的動脈銀夾縮窄大鼠的腹主動脈,假手術(shù)組只分離腹主動脈,不造成縮窄。利用小動物B超檢測心臟結(jié)構(gòu)和功能。通過心肌切

5、片的HE染色,觀察心臟形態(tài)變化。通過熒光定量PCR檢測肥厚早期標志性基因心房利尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)的mRNA表達水平。采用Westernblot方法檢測ANP和β-MHC的蛋白表達水平。結(jié)果：AAC模型組較假手術(shù)組大鼠的心臟體積變大,左心室/脛骨長度比顯著增加;在AAC-2w和AAC-3w組的大鼠,心室前后壁增大,左室間隔半徑縮短;左心室短軸縮短指數(shù)(FS％)和左心室射血分數(shù)(EF%)均顯著降低。ANP、β-M

6、HC的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高。結(jié)論：采用腹主動脈狹窄法成功建立了由壓力后負荷增加引起的大鼠心肌肥厚模型。
　　第二部分：miR-16在心肌肥厚中的表達變化
　　目的：明確大鼠心肌肥厚時miR-16的表達變化。方法：采用熒光定量PCR,檢測大鼠肥厚心肌中miR-16的宿主基因SMC4、miR-16前體及miR-16成熟體水平。采用原代分離培養(yǎng)乳大鼠心肌細胞,經(jīng)苯腎上腺素(PE)處理后,檢測ANP、β-MHC、SMC4

7、、miR-16前體及miR-16成熟體表達。結(jié)果：成功建立PE誘導的大鼠心肌細胞肥大模型,心肌細胞表面積增大,細胞RNA合成增加,ANPmRNA表達顯著上調(diào)。在整體心肌肥厚模型和肥大心肌細胞中,一致性地證實SMC4、miR-16前體及miR-16成熟體表達降低。結(jié)論：在整體和細胞水平上證實,miR-16在大鼠心肌肥厚時下調(diào)表達。
　　第三部分：miR-16對心肌細胞肥大的調(diào)控作用
　　目的：觀察miR-16表達對心肌肥大表型

8、的影響。方法：原代分離乳大鼠心肌細胞,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Negative Control(NC)、miR-16mimics、miR-16inhibitor,利用熒光定量PCR和Western blot檢測ANPmRNA和蛋白表達,利用FITC-鬼筆環(huán)肽染色顯示心肌細胞中Factin表達,EU染色顯示新合成RNA,用激光共聚焦顯微鏡觀察心肌細胞形態(tài),利用IPP軟件測量細胞表面積。結(jié)果：與轉(zhuǎn)染NC組相比,miR-16 mimics可抑制PE誘導

9、的心肌細胞中ANP表達上調(diào),以及心肌細胞表面積和新合成RNA的增加。與感染rAd-GFP對照病毒相比,感染重組miR-16病毒(rAd-miR-16)可顯著抑制PE誘導的心肌細胞中ANP表達升高,以及心肌細胞表面積和新合成RNA的增加。而轉(zhuǎn)染miR-16 inhibitor可引起乳大鼠心肌細胞出現(xiàn)肥大表型。結(jié)論：miR-16參與調(diào)控了心肌細胞肥大過程。
　　第四部分：介導miR-16調(diào)控心肌細胞肥大的靶基因鑒定
　　目的：鑒

10、定介導miR-16調(diào)控心肌細胞肥大的靶基因。利用Target Scan等生物信息學軟件預測miR-16作用的靶基因。熒光定量PCR和Western blot檢測miR-16靶基因的mRNA和蛋白表達水平。FITC-鬼筆環(huán)肽染色顯示心肌細胞表面積。結(jié)果：miR-16可靶向作用三個與細胞周期調(diào)控相關的CCND1、CCND2、CCNE1基因,在發(fā)生肥厚的大鼠心肌組織和PE誘導肥大的大鼠心肌細胞中,上述細胞周期蛋白表達升高,過表達miR-16的

11、可降低心肌細胞中CCND1、CCND2和CCNE1的蛋白水平,但對它們的mRNA水平?jīng)]影響。分別沉默CCND1、CCND2、CCNE1表達可顯著抑制PE引起的心肌細胞肥大表型。結(jié)論：CCND1、CCND2、CCNE1介導了miR-16對心肌細胞肥大的抑制作用。
　　第五部分：調(diào)控心肌肥厚時miR-16表達的信號通路研究
　　目的：探討Stat3/c-Myc信號通路在調(diào)控miR-16下調(diào)表達中的作用。方法：采用Western

12、blot方法檢測肥厚的大鼠心肌組織及PE誘導肥大的大鼠心肌細胞中p-Stat3、Stat3、p-c-Myc、c-Myc蛋白水平。分別利用相應的Stat3、c-Myc抑制劑處理大鼠心肌細胞,通過熒光定量PCR檢測miR-16成熟體的表達水平。結(jié)果：p-Stat3、p-c-Myc蛋白水平在AAC誘導肥厚的大鼠心肌組織和PE處理的乳大鼠心肌細胞中顯著上調(diào);p-Stat3、p-c-Myc的抑制劑均能明顯升高大鼠心肌細胞中miR-16表達。結(jié)論：

13、心肌肥厚時Stat3/c-Myc信號通路激活,并負調(diào)控了心肌中miR-16的表達。
　　全文總結(jié):本文在心肌組織和細胞水平上證實,心肌肥厚時miR-16成熟體、miR-16前體及宿主基因SMC4表達降低。增加miR-16表達可抑制PE引起的心肌細胞肥大表型,而抑制miR-16表達就可引起心肌細胞出現(xiàn)肥大表型。熒光定量PCR和Western blot結(jié)果證實,miR-16可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控CCND1、CCND2和CCNE1的表達。在