RNA結(jié)合蛋白QKI在脂肪細(xì)胞分化中的作用研究.pdf

1、肥胖是嚴(yán)重影響人類健康的五大流行病之一。大量研究表明，肥胖與糖尿病、冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及某些腫瘤（如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌）等疾病有關(guān)。肥胖的人由于脂質(zhì)過(guò)度堆積，使得脂肪細(xì)胞過(guò)度增殖和肥大，導(dǎo)致脂肪組織功能失調(diào)，游離脂肪酸增多，而巨噬細(xì)胞也會(huì)侵入到脂肪組織中，從而最終引起胰島素抵抗，2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生。因此對(duì)脂肪細(xì)胞的分化進(jìn)行研究，有助于闡明肥胖發(fā)生的機(jī)制，并為有效地治療其相關(guān)并發(fā)癥提供生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　在激素等激

2、活因子的作用下，前體脂肪細(xì)胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒旆只闹炯?xì)胞。一般我們將脂肪細(xì)胞分化分為兩個(gè)部分：第一個(gè)部分為多潛能的干細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成為前體脂肪細(xì)胞（adipocyte commitment）；第二個(gè)部分為前體脂肪細(xì)胞終末分化為成熟的脂肪細(xì)胞（terminal differentiation）。以往研究影響脂肪細(xì)胞分化的分子多集中于轉(zhuǎn)錄因子，如PPARγ和C/EBPα。研究表明轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα是影響脂肪細(xì)胞分化的開關(guān)基因。近來(lái)

3、許多研究表明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在脂肪細(xì)胞分化中也起著非常重要的作用。如miR-130，miR-27和miR-378可以調(diào)控成脂分化基因以及脂類合成基因來(lái)影響脂肪分化；RNA結(jié)合蛋白HuR可以通過(guò)靶向C/EBPβ而調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化。這些結(jié)果都說(shuō)明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在脂肪細(xì)胞分化中也扮演著重要的角色，對(duì)這類分子在脂肪細(xì)胞分化中的作用進(jìn)行探索和驗(yàn)證，有利于進(jìn)一步闡明脂肪分化的分子機(jī)制。
　　RNA結(jié)合蛋白QKI是STAR家族成員之一。Qk基因可以編碼

4、多種蛋白，而主要的有三種，分別命名為QKI5、QKI6和QKI7。以往的研究表明QKI參與血管和神經(jīng)的分化和發(fā)育。我們實(shí)驗(yàn)室的研究也表明，QKI參與了結(jié)腸上皮的分化過(guò)程以及巨噬細(xì)胞的分化過(guò)程。近年還有研究表明，QKI還參與了肌肉細(xì)胞的分化。生物信息學(xué)顯示QKI能夠調(diào)節(jié)FASN、COX2、SCD1以及FABP4等與脂肪分化和脂類合成密切相關(guān)的分子，提示QKI可能在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。
　　目的:
　?、偬接慟KI

5、在脂肪細(xì)胞及脂肪組織中的表達(dá)情況以及在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，初步建立QKI的表達(dá)與脂肪細(xì)胞分化的相關(guān)關(guān)系；
　?、谔接慟KI是否參與多潛能的干細(xì)胞以及前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程；
　　③闡明QKI參與調(diào)控脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的分子機(jī)制。
　　方法和結(jié)果:
　　①首先利用Western Blot、Q-PCR以及免疫熒光的方法分別在基因水平及蛋白水平檢測(cè)了QKI在多潛能的干細(xì)胞C3H10T1/2和前體脂

6、肪細(xì)胞3T3-L1中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示， QKI在這兩種未分化的細(xì)胞中都有表達(dá)，并且在多潛能的干細(xì)胞C3H10T1/2中的表達(dá)量更高。此外，我們的結(jié)果還顯示，C3H10T1/2和3T3-L1向成熟脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程中QKI的表達(dá)逐漸升高。
　?、诶寐《靖腥镜姆绞匠晒⒘薗KI過(guò)表達(dá)以及干涉的C3H10T1/2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。Western Blot和Q-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)QKI5和QKI6以及shQKI5和shQKI6在C3H1

7、0T1/2細(xì)胞中成功表達(dá)，并且過(guò)表達(dá)和干涉的作用效率都很高。
　　③Western Blot和Q-PCR檢測(cè)結(jié)果表明QKI5的過(guò)表達(dá)使得QKI6的表達(dá)升高，說(shuō)明QKI5對(duì)QKI6的表達(dá)有促進(jìn)作用。并且發(fā)現(xiàn)干涉掉QKI5以后QKI6的表達(dá)顯著降低，這與QKI5的過(guò)表達(dá)促進(jìn)QKI6的表達(dá)相一致。進(jìn)一步說(shuō)明QKI5的表達(dá)是QKI6表達(dá)的前提，如果QKI5不表達(dá)QKI6也就不表達(dá)。
　?、躋KI的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了多潛能干細(xì)胞C3H10T

8、1/2向脂肪細(xì)胞的分化；而將QKI干涉以后，脂肪細(xì)胞的分化明顯受到了抑制，無(wú)論是針對(duì)QKI5的干涉，還是針對(duì)QKI6的干涉，這種抑制作用都非常明顯。同時(shí)，干涉QKI也抑制了前體脂肪細(xì)胞3T3-L1的成脂分化。
　?、莼蛐酒治?、Western Blot以及Q-PCR的結(jié)果表明，干涉QKI抑制了脂肪特異性基因的表達(dá)。比如Pparg、Cebpa、Fabp4及AdipoQ等。
　?、蘩肁ffymetrix基因芯片分析以及Q-P

9、CR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)QKI knockdown抑制了C3H10T1/2細(xì)胞胞外基質(zhì)（ECM）基因——編碼Ⅱ型膠原α1鏈的Col2a1基因以及編碼彈性蛋白的Eln基因的表達(dá)，促進(jìn)了編碼基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的基因Mmp3、Mmp13、Mmp16的表達(dá)。
　　⑦Affymetrix基因芯片分析以及Q-PCR和Western Blot檢測(cè)的結(jié)果表明干涉QKI抑制了多潛能干細(xì)胞C3H10T1

10、/2的BMP信號(hào)通路，抑制了前體脂肪細(xì)胞3T3-L1的PI3K-AKT信號(hào)通路。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)本課題的研究，我們首次發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白QKI參與了脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)程，并闡明了其調(diào)控機(jī)制。首先，我們發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白QKI的表達(dá)在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中逐漸升高；其次，發(fā)現(xiàn)QKI異構(gòu)體QKI5和QKI6都能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化以及脂肪特異性基因的表達(dá)；最后，發(fā)現(xiàn)QKI可以調(diào)控某些細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)分子，并且闡明了QKI通過(guò)BMP及