四株CoxA16病毒免疫原性及毒株間交叉保護(hù)的比較分析.pdf

1、柯薩奇A型16病毒(Coxsackievirus group A16，CA16)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬成員，是導(dǎo)致手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）的兩大主要病原體之一。以往的研究認(rèn)為柯薩奇A型16病毒感染人體后常常會(huì)表現(xiàn)出無臨床癥狀出現(xiàn)或感染后很少出現(xiàn)重癥病例的感染方式，因此人們對(duì)其并沒有太多的深入研究。近年來關(guān)于CA16感染所致HFMD的報(bào)道已顯示在防控手足口病的工作中要加深對(duì)CA16

2、研究的重要性，尤其是在某些地區(qū)的HFMD重癥病例中由CA16所引起的比例可以占到20％以上，提示我們其致病性愈來愈引起了人們的關(guān)注，對(duì)CA16的病原學(xué)和免疫學(xué)特征的探索已經(jīng)成為樣子疫苗的重要實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究通過對(duì)近年來我國CA16分離株進(jìn)行基因分型，分析CA16在我國流行的基本分子遺傳學(xué)信息。選取出4個(gè)來自于中國大陸不同地區(qū)的CA16毒株，制備純化滅活全病毒顆粒，免疫小鼠后研究其在免疫原性和毒株間的交叉抗原方面的特性及差異，以期這些研究

3、結(jié)果為以后研發(fā)全病毒滅活顆粒CA16病毒疫苗提供一定的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。
　　本研究以CA16病毒中的VP1核苷酸序列為依據(jù)對(duì)19株CA16病毒建立種系進(jìn)化樹并進(jìn)行基因分型后，了解到我國大陸地區(qū)現(xiàn)流行的不同CA16毒株跟于1951分離出的第一株CA16病毒(國際標(biāo)準(zhǔn)株G10)在分子遺傳學(xué)上均產(chǎn)生了較大的變化。同時(shí)，從CA16的種系進(jìn)化樹中可以看出我國大陸地區(qū)2000年前所流行的CA16毒株在基因型上屬于B1基因型，而在2000～201

4、0這10年間則又經(jīng)歷了B2a到B2b基因型的變化，并且2008～2010年的分離株大部分屬于B2b基因型。同時(shí)，我們注意到不同的毒株間在核苷酸序列及編碼蛋白氨基酸序列上均存在一定的差異，這提示了我們不同的CA16毒株在抗原表型上也會(huì)產(chǎn)生一定的差異。因此我們選擇了G20、MY08、KM208和KMM/08這四個(gè)來自于中國大陸不同地區(qū)的CA16毒株，研究它們?cè)诙局瓯旧淼拿庖咴约岸局觊g交叉抗原的差別。這四個(gè)毒株均分離于2008～2010年間

5、，其中除了KMM/08為B2a基因型外，其他三個(gè)毒株均為B2b基因型。
　　在制備抗原時(shí)我們將福爾馬林滅活后的CA16病毒通過截留量為100kDa的切向流過濾裝置進(jìn)行濃縮40倍后，用AKTA purifier層析純化系統(tǒng)進(jìn)行層析純化，純化后的樣品經(jīng)ELISA檢測(cè)樣品中的病毒抗原。純化好的抗原均以640EU/只的抗原量免疫BALB/c雌性小鼠，每組6只。研究中我們通過Western Blotting的方法驗(yàn)證了CA16免疫血清中的中

6、和抗體可以識(shí)別CA16病毒中的結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2。
　　在隨后對(duì)這四株CA16毒株本身的免疫原性進(jìn)行比較分析時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)G20、KMM/08和KM208這三個(gè)毒株純化后的滅活病毒顆粒免疫小鼠后均能顯示出較好的免疫原性，顯著性優(yōu)于MY08毒株(P＜0.05)。我們知道可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體的主要中和抗原表位位于VP1上，因此我們對(duì)這四個(gè)毒株VP1的氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果表明G20、KMM/08和KM208這三個(gè)毒株在

7、VP1蛋白氨基酸序列上完全一致，而MY08毒株則跟這三個(gè)毒株在VP1蛋白氨基酸序列上存在三個(gè)差異氨基酸位點(diǎn)。通過進(jìn)一步的分析我們發(fā)現(xiàn)MY08毒株在VP1上第102位氨基酸位點(diǎn)的突變(N→D)屬于中性氨基酸突變?yōu)樗嵝园被?，并且這個(gè)突變位點(diǎn)正好發(fā)生于VP1第94～108位氨基酸肽段（TMPTTGTGTGTGNTDGYVN）的一個(gè)保守型線性中和抗原表位上。另外，第102位氨基酸由N→D的突變也可使該抗原表位的親和力下降。以上信息提示MY08

8、毒株與其他毒株相比顯示出了較弱的免疫原性可能與該區(qū)域的突變有關(guān)。
　　在毒株間交叉抗原保護(hù)性的研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這四個(gè)毒株間都存在著不同程度的交叉保護(hù)作用。通過交叉中和試驗(yàn)測(cè)定它們之間的交叉中和抗體效價(jià)后發(fā)現(xiàn)G20、KMM/08和KM208這三個(gè)毒株對(duì)其他毒株的交叉保護(hù)性優(yōu)于MY08對(duì)其他毒株的交叉保護(hù)性，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，這跟MY08本身較弱的免疫原性存在一定的關(guān)系。另外，G20、KMM/08和KM208