水貂源偽狂犬病毒DL14-08株的分離鑒定及免疫原性研究.pdf

1、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的毛皮動(dòng)物偽狂犬病(Pseudorabies，PR)近幾年在我國東北、華北等地區(qū)的13個(gè)省市流行爆發(fā)并有蔓的延趨勢(shì)。近期流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道偽狂犬毒株多呈變異情況，與市場(chǎng)上生產(chǎn)的疫苗毒株同源性相差較大，并存在接種過偽狂犬疫苗的動(dòng)物仍然存在發(fā)病的情況。而該病在毛皮動(dòng)物發(fā)病迅速，死亡率高的特點(diǎn)，且當(dāng)前并無針對(duì)毛皮動(dòng)物的疫苗等有效的防控手段，給毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。所以，研究

2、當(dāng)前毛皮動(dòng)物中流行毒株的變異性和針對(duì)新型毒株研制針對(duì)毛皮動(dòng)物的疫苗，對(duì)PR的防控意義重大。
　　本研究通過對(duì)2012年至2014年東北三省、山東、河北等地收集的疑似感染PRV的水貂、狐貍等病料中進(jìn)行病毒分離工作，在遼寧省大連地區(qū)發(fā)病水貂的腦組織中分離出一株水貂源PRV，通過PCR鑒定、細(xì)胞增殖、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)、電鏡觀察、動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)等證實(shí)該毒株為PRV，命名為DL14/08株。對(duì)水貂源DL14/08株病毒的全基因組序列測(cè)定，并針

3、對(duì)全基因組與gC基因與經(jīng)典毒株比對(duì)分析，建立了系統(tǒng)發(fā)育樹，同時(shí)針對(duì)全基因組的氨基酸變異情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。分析發(fā)現(xiàn)，DL14/08株與國內(nèi)近兩年分離出的JS-2012，ZJ01，HeN1，HNB, TJ等株相似性較高為97％～100％，而與疫苗株的相似性較低為67％～82％。本研究在基因?qū)用娓玫慕忉屃私鼛啄甏笠?guī)模爆發(fā)流行的豬源PR以及毛皮動(dòng)物PR遺傳特征和親緣關(guān)系提供了有力的數(shù)據(jù)支持。
　　針對(duì)毛皮動(dòng)物源偽狂犬病，本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過毒株的

4、純化與篩選最終利用DL14/08毒株作為種毒進(jìn)行滅活疫苗的制備。經(jīng)PK-15細(xì)胞增殖測(cè)定其病毒含量為10710TCID50/mL，病毒純化培養(yǎng)后，參照《獸用生物制品規(guī)程》制備水貂源PR滅活疫苗。滅活疫苗的制備采用0.2％的甲醛溶劑對(duì)毒液滅活，5％氫氧化鋁膠作為佐劑，按一定比例配制后振搖滅活7d，4℃保存。對(duì)制備好的滅活水貂PR疫苗進(jìn)行物理性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、滅活檢驗(yàn)，均符合標(biāo)準(zhǔn)后分別在水貂和家兔上進(jìn)行安全性檢驗(yàn)，持續(xù)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精神狀態(tài)

5、和體溫確定制備疫苗的安全性。最終獲得性狀良好且安全可靠的滅活水貂源PR疫苗。
　　為了研究比較DL14/08株制備的滅活疫苗的免疫效力情況以及動(dòng)物接種之后是否有不良反應(yīng)，設(shè)計(jì)了三個(gè)個(gè)實(shí)驗(yàn)。首先通過對(duì)水貂和家兔接種不同劑量的疫苗并攻毒，從而確定水貂源滅活PR疫苗對(duì)水貂的最小免疫劑量為5×10610 TCID50/mL。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)為攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，利用豬源PR滅活疫苗鄂A株與本實(shí)驗(yàn)中所制備的水貂源滅活PR疫苗進(jìn)行了比較。按照各疫苗要求劑

6、量分別免疫水貂與家兔兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，免疫21d后按100LD50對(duì)家兔和水貂攻毒，監(jiān)測(cè)兩種滅活疫苗對(duì)動(dòng)物的保護(hù)效力情況。水貂源PR疫苗對(duì)水貂與家兔的保護(hù)率均為100％;商品化豬源PR滅活疫苗對(duì)家兔保護(hù)率100％，對(duì)水貂保護(hù)率為80％。第三個(gè)實(shí)驗(yàn)，監(jiān)測(cè)了水貂在接種兩種不同的滅活疫苗后血清PR中和抗體在六個(gè)月內(nèi)的變化情況。在病毒含量為100 TCID50/mL的條件下測(cè)定水貂源DL14/08株疫苗刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的抗體最高效價(jià)達(dá)到1∶516，