SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元凋亡與線粒體融合蛋白Mfn1-Mfn2的表達(dá)及SS31肽的保護(hù)作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能下降為主要表現(xiàn)，伴有人格和行為異常的年齡相關(guān)的常見(jiàn)神經(jīng)變性病。AD病人的病理改變主要有Aβ炎性斑、過(guò)度磷酸化的Tau蛋白形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)、線粒體/突觸結(jié)構(gòu)和功能改變及神經(jīng)元減少。其發(fā)病機(jī)制有能量代謝假說(shuō)、氧化應(yīng)激假說(shuō)、淀粉樣蛋白（amyloid）級(jí)聯(lián)反應(yīng)假說(shuō)、膽堿能假說(shuō)等，但其具體機(jī)制尚未完全闡明。AD的發(fā)病率正逐年增長(zhǎng)，給越來(lái)越多的AD病人及其家庭的

2、生活、工作造成不便。目前最常用的AD模型為快速老化模型SAMP8模型。
　　實(shí)驗(yàn)顯示AD與氧化應(yīng)激及線粒體功能異常有關(guān)。ROS主要在線粒體產(chǎn)生，并主要作用于線粒體，使線粒體數(shù)量減少，引起神經(jīng)元一系列變化，促進(jìn)細(xì)胞死亡。神經(jīng)細(xì)胞組成成分被過(guò)度氧化時(shí)，調(diào)節(jié)凋亡的相關(guān)蛋白表達(dá)水平發(fā)生改變，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。對(duì)神經(jīng)元的凋亡有調(diào)控作用的因子有:Caspase家族、線粒體融合基因和分裂基因表達(dá)及Bcl-2家族等。凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族中Bc

3、l-2能抑制凋亡，Bax能促進(jìn)凋亡。Mfn1、Mfn2為線粒體融合基因。研究顯示，融合基因表達(dá)在大多數(shù)嚴(yán)重的AD病人中下降較為明顯，其中Mfn1下降最明顯。融合基因表達(dá)減少使線粒體數(shù)量減少，ATP形成障礙，神經(jīng)元變性，促進(jìn)AD的發(fā)生。抗氧化劑的應(yīng)用可抑制氧化應(yīng)激，減輕線粒體結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，減少細(xì)胞凋亡，改善AD病人的認(rèn)知功能。SS31是一種抗氧化四肽，大多位于線粒體內(nèi)膜。研究顯示，它能減少線粒體活性氧產(chǎn)生、清除活性氧、抑制脂質(zhì)等物質(zhì)

4、過(guò)氧化、抑制線粒體通透性改變、保護(hù)線粒體功能、減少細(xì)胞死亡，SS31對(duì)與細(xì)胞氧化損傷及線粒體功能障礙有關(guān)的各種神經(jīng)變性病有效。
　　目的:觀察快速老化模型SAMP8(senescence-accelerated mouse prone8)小鼠和SAMR1(senescence accelerated mouse resistant1)小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)融合蛋白Mfn1(Mitofusin1)和Mfn2(Mitofusin2)表達(dá)及凋

5、亡相關(guān)蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma-2)和Bax(Bcl-2 Assaciated(X) protein)表達(dá)情況;探討線粒體靶向抗氧化肽SS31對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervoussystem CNS)是否有保護(hù)作用;并為抗衰老及AD的防治提供新的理論指導(dǎo)。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選取8月齡健康雄性SAMR1小鼠和SAMP8小鼠，將SAMP8小鼠隨機(jī)分為三組，第一組不予干預(yù)為P8模型

6、對(duì)照組(Model group)，第二組注射生理鹽水5mg/kg/d為溶媒對(duì)照組(Vehicle group)，第三組腹腔注射SS315mg/kg/d為SS31處理組(SS31)。SAMR1小鼠注射生理鹽水5mg/kg/d為R1正常對(duì)照組(Normal control group)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為四組。
　　2.HE染色
　　小鼠干預(yù)完畢后冰上斷頭取腦，于鼠腦視交叉至上丘之間的部位切取5um海馬標(biāo)本。應(yīng)用HE染色技術(shù)染色，在

7、光鏡下四組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)病理學(xué)變化。
　　3.免疫組化
　　小鼠干預(yù)完畢后冰上斷頭取腦，于鼠腦視交叉至上丘之間的部位切取5um海馬標(biāo)本。應(yīng)用免疫組化技術(shù)，在光鏡下觀察四組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況。
　　4.電鏡技術(shù)
　　小鼠干預(yù)完畢后冰上斷頭取腦，于鼠腦視交叉至上丘之間的部位分離出海馬組織，切成1×1×1mm的組織塊，用4％戊二醛固定，電鏡技術(shù)檢測(cè)。
　　5.蛋白印

8、跡
　　小鼠干預(yù)完畢后冰上斷頭取腦，將海馬迅速分離出來(lái)，提取海馬總蛋白，用Western Blot技術(shù)定量檢測(cè)海馬中Mfn1、Mfn2蛋白含量變化。
　　結(jié)果:
　　1.HE染色
　　SAMR1正常對(duì)照組海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞邊界、輪廓清晰，排列整齊、致密，核仁顯示明顯，胞核無(wú)固縮;P8模型對(duì)照組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞減少且雜亂，核仁顯示不清楚、甚至消失，核固縮;SS31處理組小鼠海馬CA1、

9、CA3區(qū)細(xì)胞較溶媒對(duì)照組細(xì)胞邊界、核仁稍清晰，胞核固縮、細(xì)胞數(shù)減少改善，但沒(méi)有恢復(fù)到SAMR1正常對(duì)照組水平。
　　2.免疫組化
　　2.1 Bcl-2蛋白表達(dá)Bcl-2蛋白主要在海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞胞漿表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞為淺黃色或黃褐色，背景染色較淺。P8模型對(duì)照組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞較SAMR1正常對(duì)照組減少，SS31處理組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞較溶媒對(duì)照組增多，但沒(méi)有恢復(fù)到SAM

10、R1正常對(duì)照組水平。陰性對(duì)照切片無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞。
　　2.2 Bax蛋白表達(dá)Bax蛋白主要在海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞胞漿表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞為淺黃色或黃褐色，背景染色較淺。P8模型對(duì)照組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞較SAMR1正常對(duì)照組增多，SS31處理組小鼠海馬CA1、CA3區(qū)陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞較溶媒對(duì)照組減少，但沒(méi)有恢復(fù)到SAMR1正常對(duì)照組水平。陰性對(duì)照切片無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞。
　　3.透射電鏡
　　SAMR1小鼠以正

11、常神經(jīng)元為主，很少見(jiàn)典型的凋亡細(xì)胞。SAMP8模型對(duì)照組小鼠海馬組織細(xì)胞減少，排列雜亂。海馬神經(jīng)元凋亡樣改變?cè)龆?，胞漿內(nèi)線粒體輕度腫脹，并出現(xiàn)較多空泡，部分僅見(jiàn)細(xì)胞輪廓。SS31處理組小鼠海馬神經(jīng)元較溶媒對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量增多，神經(jīng)元細(xì)胞、線粒體變化較輕，但沒(méi)有恢復(fù)到SAMR1正常對(duì)照組水平。
　　4.蛋白印跡
　　4.1 Mfn1蛋白的表達(dá)與SAMR1正常對(duì)照組相比，P8模型對(duì)照組Mfn1蛋白表達(dá)降低(P＜0.05); SS3

12、1處理組與溶媒對(duì)照組相比，Mfn1蛋白表達(dá)增高(P＜0.05)，但與SAMR1正常對(duì)照組相比仍降低(P＜0.05）。溶媒對(duì)照組和P8模型對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　4.2 Mfn2蛋白的表達(dá)與SAMR1正常對(duì)照組相比，P8模型對(duì)照組Mfn2蛋白表達(dá)降低(P＜0.05); SS31處理組與溶媒對(duì)照組相比，Mfn2蛋白表達(dá)增高(P＜0.05），但與SAMR1正常對(duì)照組相比仍降低(P＜0.05）。溶媒對(duì)照組和P8模型對(duì)

13、照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.在SAMP8小鼠中，海馬神經(jīng)細(xì)胞減少，細(xì)胞及線粒體形態(tài)異常，Bax蛋白表達(dá)增多，Bcl-2蛋白的表達(dá)降低。線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2表達(dá)降低。提示SAMP8小鼠中細(xì)胞凋亡增加，線粒體動(dòng)力學(xué)失衡與神經(jīng)細(xì)胞損傷有關(guān)。
　　2.在SS31干預(yù)下，海馬神經(jīng)細(xì)胞和線粒體異常有所恢復(fù)，海馬神經(jīng)細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)增多;線粒體融合蛋白Mfn1和