水稻脂肪氧化酶RNA干擾載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化水稻進(jìn)行耐儲(chǔ)藏的研究.pdf

1、糧食安全是一個(gè)全球性的戰(zhàn)略問(wèn)題，是關(guān)系到國(guó)家乃至世界政治穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的大事。我國(guó)有65％以上的人口以大米為主食，水稻擔(dān)當(dāng)著我國(guó)糧食安全的第一重任，而糧食貯備又是其中重要的一環(huán)。我國(guó)每年因稻谷陳化問(wèn)題損失的包括作為食用和種用的稻谷占總產(chǎn)量的3%，造成幾十億元的經(jīng)濟(jì)損失。稻谷在一般貯藏條件下第二年就會(huì)產(chǎn)生陳化變質(zhì)現(xiàn)象，高溫高濕地區(qū)則更快。為此，我國(guó)儲(chǔ)備糧通常采用分散分批、定期推陳儲(chǔ)新、輪流更新的方法，耗費(fèi)了大量的人力、物力和財(cái)力。

2、　　近年來(lái)的研究表明，稻谷貯藏期間脂質(zhì)的降解是導(dǎo)致其品質(zhì)下降并產(chǎn)生陳味的主要原因之一，其中脂氧合酶是脂質(zhì)降解的關(guān)鍵酶。因此從理論上講，lox的缺失可以明顯地阻止脂質(zhì)過(guò)氧化作用，減緩貯藏糧食氧化變質(zhì)的速度，保持清新氣味，提高耐貯性。
　　通過(guò)搜索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)引物。通過(guò)PCR技術(shù)從玉米和水稻DNA中分別克隆了玉米泛素啟動(dòng)子（Ubi組成型）和水稻種子脂肪氧化酶基因的特異啟動(dòng)子（SL特異型）、玉米泛素第一個(gè)內(nèi)含子（IN）。從

3、植物真核表達(dá)載體 pBI121上克隆終止子NOS。克隆的玉米泛素啟動(dòng)子與已知的序列同源性為99.6%,其它序列同源性均為100%。通過(guò)比對(duì)多種植物的lox基因，找到同源性比較高的序列。利用RT-PCR技術(shù)從水稻總RNA中克隆得到了一對(duì)反向互補(bǔ)序列的lox基因片段（G1和G2）。
　　為了確定我們克隆的玉米泛素啟動(dòng)子是否有活性。我們用玉米泛素啟動(dòng)子替代了植物真核表達(dá)載體pBI121中的35S啟動(dòng)子，GUS染色結(jié)果顯示此啟動(dòng)子的活性很

4、高。
　　利用植物真核表達(dá)載體 pCAMBIA1301和上述片段，通過(guò)構(gòu)建中間載體的方法，使構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單化，構(gòu)建了兩個(gè)植物RNAi表達(dá)載體，并通過(guò)酶切檢測(cè)可知構(gòu)建成功，兩個(gè)載體含有如下部分：1) p13UL，含玉米泛素啟動(dòng)子、含內(nèi)含子的lox cDNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)及潮霉素選擇標(biāo)記基因hpt;2) p13SL,含水稻種胚脂肪氧化酶基因的特異啟動(dòng)子、含內(nèi)含子的lox cDNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)及潮霉素選擇標(biāo)記基因hpt。
　　利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

5、將p13UL和p13SL兩個(gè)載體分別轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織中。得到再生植株，得到的再生植株品系均為中花16號(hào)。PCR檢測(cè)基因組DNA顯示，轉(zhuǎn)p13SL載體的14株轉(zhuǎn)基因植株中得到4株陽(yáng)性植株，轉(zhuǎn)p13UL載體的6株轉(zhuǎn)基因植株中得到3株陽(yáng)性植株。這說(shuō)明兩個(gè)載體都插入水稻基因組中。
　　為了研究插入基因組的RNAi片段是否可以表達(dá)并起到基因敲除的作用，我們利用了傷害可以誘導(dǎo)lox基因大量表達(dá)這一特性，對(duì)轉(zhuǎn)入p13UL的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行傷