高表達(dá)Caveolin-1抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的信號傳遞機(jī)制研究.pdf

1、血管生成(angiogenesis)是指在原有的血管床上產(chǎn)生新血管的過程。它在胚胎發(fā)育、傷口修復(fù)、組織再生、腫瘤生長等生理、病理過程中起重要作用。血管生成包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化等過程，其中內(nèi)皮細(xì)胞增殖是血管生成的關(guān)鍵步驟。內(nèi)皮細(xì)胞增殖是在促血管生成因子和抑制血管生成因子以及細(xì)胞外基質(zhì)的共同作用下發(fā)生的?！?最近研究顯示，Caveolin-1與血管生成有關(guān)。VEGF刺激牛動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)后Caveolin-1的表達(dá)降

2、低。在ECV304細(xì)胞系中，高表達(dá)Caveolin-1抑制Elk1基因的轉(zhuǎn)錄，高表達(dá)Caveolin-1抑制NIH3T3成纖維細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞增殖。一些研究顯示Caveolin-1是抑癌基因。但是，Caveolin-1抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的機(jī)制還未見報道。 本研究以腺病毒介導(dǎo)在HUVEC(humanumbilicalveinendothelialcell，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)中高表達(dá)Caveolin-1蛋白，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞增殖分

3、析、細(xì)胞周期分析、Western印跡雜交等技術(shù)，檢測Caveolin-1對由VEGF誘導(dǎo)的Ras-p42/44MAPK信號通路的作用，對細(xì)胞周期抑制蛋白p27Kip1水平的影響，以及其對細(xì)胞外基質(zhì)Fibronectin引起的整合素-FAK信號通路的影響，初步闡釋Caveolin-1在內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的作用機(jī)制，為以Cave-olin-1為靶分子抑制血管生成來治療腫瘤提供理論依據(jù)。 材料及方法： 一、材料與試劑 1.

4、HUVEC細(xì)胞制備HUVEC細(xì)胞分離于人的新鮮臍帶。膠原酶消化臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞10分鐘后分離內(nèi)皮細(xì)胞，將內(nèi)皮細(xì)胞接種于用明膠預(yù)處理過的培養(yǎng)皿，完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，取第3代到第6代內(nèi)皮細(xì)胞用于實驗。 2.腺病毒制備腺病毒Ad-tTA(輔助蛋白tTA重組腺病毒)、Ad-GFP(綠色熒光蛋白重組腺病毒)、Ad-Cav-1(Caveolin-1重組腺病毒)在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增，CsCl密度梯度離心法純化腺病毒，PD10sephadex

5、G-25柱脫鹽，-80℃深凍冰箱凍存?zhèn)溆谩?二、腺病毒介導(dǎo)在HUVEC細(xì)胞高表達(dá)Caveolin-1蛋白將HUVEC細(xì)胞接種在明膠預(yù)處理過的六孔板上，待細(xì)胞長至每孔1X105細(xì)胞時，加入相應(yīng)腺病毒感染內(nèi)皮細(xì)胞1小時后，加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，在24-48小時之間，用Western印跡分析Caveolin-1和GFP蛋白的表達(dá)，在熒光顯微鏡下檢測病毒感染效率，確定最佳病毒滴度。本研究對照組細(xì)胞為感染腺病毒表達(dá)GFP蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞和未感

6、染腺病毒的內(nèi)皮細(xì)胞。 三、H3-胸腺嘧啶摻入法分析HUVEC細(xì)胞增殖將細(xì)胞接種于96孔板，密度為每孔2000細(xì)胞，完全培養(yǎng)液中生長24小時后，用PBS洗1次，用含0.5％FBSMCDB培養(yǎng)液饑餓過夜，分別以10ng/mlVEGF以及完全培養(yǎng)液(含15％FBS)孵育細(xì)胞48小時，加入H3-胸腺嘧啶孵育4小時后，用預(yù)冷的PBS洗3次，順次以甲醇、10％TCA固定細(xì)胞，用NaOH溶液室溫裂解內(nèi)皮細(xì)胞，收集裂解液，加入液閃液測H3-胸腺

7、嘧啶摻入量。 四、KDR磷酸化水平和p42/44MAPK磷酸化水平分析將HUVEC細(xì)胞接種在明膠預(yù)處理過的六孔板上，待細(xì)胞長至約每孔1×105細(xì)胞時，用0.5％FBSMCDB饑餓細(xì)胞16小時，然后用100uMNa3VO4處理細(xì)胞5分鐘后，以10ng/mlVEGF刺激細(xì)胞5分鐘，棄培養(yǎng)液，加入煮沸的上樣緩沖液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，100℃變性5分鐘，10％SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白到尼龍膜上，以KDR1054酪氨

8、酸殘基磷酸化抗體和p42/44MAPK磷酸化抗體分別檢測KDR磷酸化水平和p42/44MAPK磷酸化水平。 五、Caveolin-1與FAK免疫共沉淀分析用預(yù)冷的PBS緩沖液洗HUVEC細(xì)胞2次，加入裂解緩沖液，冰上孵育10分鐘裂解細(xì)胞，收集裂解液，5000rpm4℃離心5分鐘，取上清液，測定蛋白濃度，取200μgHUVEC蛋白，加入3ugFAK抗體，于4℃搖床溫育4小時后加入40ulproteinA/Gbeads，4℃過夜，以

9、清洗緩沖液清洗beads3次，每次5分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入40μl2×SDS上樣緩沖液，100℃變性5分鐘，取20ul上清液以SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白到尼龍膜上，以Caveolin-1抗體檢測FAK是否與Caveolin-1發(fā)生免疫共沉淀。 六、FAK活性分析腺病毒感染HUVEC細(xì)胞48小時后，胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞接種在fi-bronectin處理過的6孔板上30分鐘后，棄培養(yǎng)液，加入300ul1×SDS

10、煮沸的上樣緩沖液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，100℃變性5分鐘，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白到尼龍膜上，以FAK抗體和FAK397酪氨酸殘基磷酸化抗體分別檢測FAK水平和FAK397酪氨酸殘基磷酸化水平。 七、細(xì)胞周期抑制蛋白P27kip1的水平分析 接種HUVEC細(xì)胞于0.2％膠原蛋白預(yù)處理過的六孔板，待細(xì)胞長至每孔約1×105細(xì)胞時，用0.5％FBSMCDB饑餓細(xì)胞16小時后，以10ng/mlVEGF刺激HU

11、VEC，在0、8、12、24小時時間點(diǎn)用PBS洗細(xì)胞1次，每孔加入250μl煮沸的上樣緩沖液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，100℃變性5分鐘，12％SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白到尼龍膜上，以P27kip1抗體檢測P27kip1水平。 八、細(xì)胞周期分析接種HUVEC細(xì)胞于0.2％明膠預(yù)處理過的六孔板，待細(xì)胞長至每孔約1×105細(xì)胞時，用1％FBSMCDB饑餓細(xì)胞18小時后，加入完全培養(yǎng)液刺激細(xì)胞16小時。在這兩個時間點(diǎn)收集

12、細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測HUVEC細(xì)胞周期分布。 九、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗分析組間差異。P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 一、腺病毒介導(dǎo)的在HUVEC細(xì)胞中高表達(dá)Caveolin-1蛋白為了研究Caveolin-1對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，我們采用腺病毒作為載體在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)外源Caveolin-1。實驗結(jié)果顯示：Ad-GFP20pfu和Ad-tTA100pfu時觀測到有90％以上

13、細(xì)胞被感染表達(dá)GFP蛋白，而Ad-cav-1200pfu和Ad-tTA200pfu時，約90％的細(xì)胞表達(dá)外源Caveolin-1蛋白。在本研究中，應(yīng)用此病毒滴度來轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于實驗分析，以為未感染腺病毒的HUVEC細(xì)胞和感染腺病毒表達(dá)GFP蛋白的HUVEC細(xì)胞為對照組細(xì)胞。 二、高表達(dá)Caveolin-1抑制人HUVEC細(xì)胞增殖與對照組細(xì)胞相比，感染腺病毒高表達(dá)Caveolin-1的HUVEC細(xì)胞中，血清誘導(dǎo)的H3-胸腺嘧啶摻入量

14、降低了67％(P＜0.05)，VEGF誘導(dǎo)的H3-胸腺嘧啶摻入量降低了35％(P＜0.05)。 三、高表達(dá)Caveolin-1抑制KDR1054酪氨酸殘基和p42/44MAPK磷酸化 血清饑餓細(xì)胞16小時后，檢測不到KDR1054酪氨酸殘基磷酸化信號，VEGF刺激10分鐘后，與對照組細(xì)胞相比，感染腺病毒高表達(dá)Caveolin-1的HUVEC細(xì)胞中，KDR1054酪氨酸殘基的磷酸化水平和p42/44MAPK磷酸化水平明顯降

15、低。 四、FAK與Caveolin-1可形成免疫共沉淀復(fù)合體與未加抗體的內(nèi)皮細(xì)胞裂解液相比，在加入FAK抗體的內(nèi)皮細(xì)胞裂解液中檢測到較強(qiáng)的Caveolin-1信號。 五、高表達(dá)Caveolin-1抑制FAK磷酸化 與對照組細(xì)胞相比，感染腺病毒高表達(dá)Caveolin-1的HUVEC細(xì)胞中，F(xiàn)AK397酪氨酸殘基磷酸化受到明顯抑制。 六、Caveolin-1對細(xì)胞周期抑制蛋白P27kip1的影響 感染

16、腺病毒的HUVEC細(xì)胞用0.5％FBSMCDB饑餓后，以10ng/mlVEGF刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在0、8小時，與對照組細(xì)胞相比，感染腺病毒高表達(dá)Caveolin-1的HUVEC細(xì)胞中，Caveolin-1的表達(dá)增高伴隨著P27Kip1水平的增高。刺激12小時后，P27Kip1水平在對照組細(xì)胞和高表達(dá)Caveolin-1的細(xì)胞中趨于一致。 七、高表達(dá)Caveolin-1抑制內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入S期 在1％FBSMCDB饑餓內(nèi)皮細(xì)胞18

17、小時后，對照組細(xì)胞與高表達(dá)Cave-olin-1的細(xì)胞周期分布相比，S期分布有差異(P=0.039)，G0/G1期、G2/M期無顯著性差異。在含血清的完全培養(yǎng)液中刺激16小時后，對照組細(xì)胞約52％處于G0/G1期，約35％處于S期，與高表達(dá)Caveolin-1的細(xì)胞周期分布有顯著差異(p＜0.05)，此時高表達(dá)Caveolin-1的HUVEC細(xì)胞周期分布為G0/G1期70.5±2.6％，S期為19.6±1.3％。由此可見，高表達(dá)Cave