納米給藥系統(tǒng)跨內(nèi)耳圓窗膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的研究.pdf

1、通過(guò)圓窗膜給藥的內(nèi)耳局部給藥系統(tǒng)由于其有效性，非侵入性，繞過(guò)血迷路屏障以及降低在非靶向部位的毒性等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到耳科學(xué)家的青睞。近年來(lái)，納米粒給藥系統(tǒng)在內(nèi)耳局部給藥方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，其小粒徑、高比表面積及高活性可以使納米粒有效穿透體內(nèi)的各種生物學(xué)屏障。目前有關(guān)于納米藥物在內(nèi)耳的研究主要集中于內(nèi)耳的組織分布，藥動(dòng)學(xué)以及藥效學(xué)研究。但是圓窗膜作為納米粒局部給藥系統(tǒng)主要的生物學(xué)屏障，目前并沒(méi)有對(duì)納米粒與圓窗膜之間的相互作用進(jìn)行研究。而了解

2、清楚納米?？缭綀A窗膜的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究對(duì)于納米粒的進(jìn)一步合理化設(shè)計(jì)是非常關(guān)鍵的。
　　聚乳酸羥基乙酸（PLGA）是FDA批準(zhǔn)的可生物降解的藥用輔料，在內(nèi)耳納米粒給藥系統(tǒng)方面有著非常廣泛的應(yīng)用，采用乳化溶劑揮發(fā)法將香豆素-6包載入PLGA，制備香豆素-6標(biāo)記的PLGA納米粒，對(duì)其在圓窗膜的通透性及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行研究。豚鼠，鼓室注射PLGA納米粒30min后，分離出圓窗膜進(jìn)行膜鋪片操作，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)香豆素-6的綠色熒

3、光在圓窗膜中廣泛分布，說(shuō)明納米?？梢赃M(jìn)入圓窗膜；同時(shí)采集納米粒給藥后的外淋巴樣本進(jìn)行透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)納米?？梢砸酝暾问竭M(jìn)入外淋巴，說(shuō)明了納米粒鼓室給藥后，可以穿越圓窗膜到達(dá)外淋巴空間。通過(guò)改變鼓室注射PLGA納米粒的濃度，選用了0.01g/ml，0.03g/ml及0.09g/ml三個(gè)濃度點(diǎn)對(duì)納米粒穿越圓窗膜進(jìn)行濃度依賴性考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)圓窗膜內(nèi)的熒光量隨著給藥濃度的增加而增加。選用了10min，30min及60min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)PLG

4、A納米粒穿過(guò)圓窗膜進(jìn)行時(shí)間依賴性考察，發(fā)現(xiàn)在給藥30min內(nèi)，圓窗膜內(nèi)的熒光量隨著時(shí)間的增加而增加，但是在30 min后，隨著時(shí)間的增加而降低。
　　對(duì)鼓室注射PLGA納米粒30 min的豚鼠圓窗膜進(jìn)行透射電鏡觀察，與正常組的圓窗膜相比，給藥組的圓窗膜中發(fā)現(xiàn)了大量的內(nèi)吞及胞吐小泡，同時(shí)圓窗膜外上皮細(xì)胞之間的緊密連接并沒(méi)有打開(kāi)，因此可知PLGA跨越圓窗膜主要是通過(guò)內(nèi)吞的方式進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，而不是通過(guò)細(xì)胞旁路途經(jīng)。采用

5、抑制不同內(nèi)吞途徑的抑制劑，發(fā)現(xiàn)PLGA納米粒主要是以小窩蛋白以及巨胞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞內(nèi)的溶酶體進(jìn)行熒光標(biāo)記，采用激光掃描共聚焦共定位技術(shù)，對(duì)溶酶體及香豆素-6標(biāo)記的PLGA納米粒進(jìn)行共定位，發(fā)現(xiàn)納米粒攝取進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)進(jìn)入細(xì)胞的溶酶體。采用與高爾基體相關(guān)的抑制劑發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體可以介導(dǎo)納米粒的胞吐。
　　對(duì)內(nèi)耳疾病進(jìn)行合理有效的治療很大程度上取決于耳蝸內(nèi)恒定的藥物濃度。殼聚糖（Chitosan,CS）是

6、一種生物可降解的聚合物，由于其粘附特性是一種優(yōu)良的藥物載體，可以增加納米粒與圓窗膜的接觸時(shí)間，同時(shí)殼聚糖具有打開(kāi)上皮細(xì)胞間緊密連接的作用，可以增加納米粒的細(xì)胞旁路途經(jīng)。采用離子交聯(lián)法制備載香豆素-6的CS納米粒，鼓室給藥后進(jìn)行圓窗膜鋪片，采用激光掃描共聚焦顯微鏡成像后得到的圓窗膜的3D重建圖像以及外淋巴的透射電鏡充分證明了殼聚糖納米粒可以穿過(guò)圓窗膜進(jìn)入外淋巴。對(duì)殼聚糖跨越圓窗膜進(jìn)行時(shí)間依賴性考察，選取了5個(gè)給藥時(shí)間點(diǎn)，10min、30m

7、in、1h、2h及4h，結(jié)果顯示在給藥60min以前，圓窗膜中香豆素-6的熒光量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但是在60min到240min的時(shí)間段內(nèi)逐漸減弱；通過(guò)改變殼聚糖納米粒給藥的濃度，選用了3個(gè)濃度點(diǎn)5mg/ml，10mg/ml及20mg/ml，發(fā)現(xiàn)圓窗膜中殼聚糖納米粒的熒光量隨著給藥納米粒濃度的增加而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　納米粒進(jìn)入上皮屏障有細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間兩種途徑，采用透射電鏡對(duì)殼聚糖給藥后的圓窗膜進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)殼聚糖納米

8、?？梢砸约?xì)胞旁路及跨細(xì)胞兩種方式進(jìn)入圓窗膜。采用不同途徑的內(nèi)吞抑制劑處理圓窗膜發(fā)現(xiàn)殼聚糖納米粒以小窩蛋白，網(wǎng)格蛋白及巨胞飲三種途徑進(jìn)入圓窗膜細(xì)胞，說(shuō)明了殼聚糖納米粒與圓窗膜細(xì)胞之間的非特異性相互作用。采用熒光共定位技術(shù)觀察到了殼聚糖納米粒在溶酶體的分布，高爾基體相關(guān)的抑制劑說(shuō)明殼聚糖納米粒可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體的介導(dǎo)下胞吐出細(xì)胞。
　　綜上所述，本課題第一次直觀證明了PLGA納米粒及CS納米粒確實(shí)可以穿過(guò)圓窗膜到達(dá)外淋巴，并闡明了