棉花抗黃萎病全基因組關聯分析及TIR--NBS--LRR類抗病基因GhTNL1功能研究.pdf

1、我國棉花黃萎病主要病原為大麗輪枝菌（Verticillium dahliae），黃萎病的發(fā)生嚴重影響了棉花產量和品質，目前選育優(yōu)異的抗病品種是防治黃萎病最為有效的措施。全基因組關聯分析(GWAS)研究策略有利于充分利用自然群體中的歷史重組事件，群體遺傳變異豐富，對于抗性位點的定位具有更高的分辨率。陸地棉（Gossypium hirsutum）TM-1基因組測序工作的完成，為開展GWAS分析以及基因克隆提供了有力的支撐。
　　本研究

2、以299份優(yōu)異棉花種質構建陸地棉抗黃萎病關聯群體。SLAF測序得到覆蓋26條染色體的85，630個高質量SNPs。群體內個體間親緣關系評估顯示群體含有豐富的遺傳變異，個體間親緣關系較遠，對全基因組關聯分析干擾較小。主成分分析和系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，群體主要可以分為2組，其中組Ⅰ主要來自于長江流域棉區(qū)(YZR)，組Ⅱ主要來自黃河流域棉區(qū)(YR)和西北內陸棉區(qū)(NW)，盡管在這兩組內也發(fā)現不同程度的個體滲入，但是分組與個體的地理來源存在一定的相

3、關性。
　　基于不同環(huán)境下表型數據分別與基因型數據進行關聯，共鑒定了17個與大麗輪枝菌響應顯著相關的SNPs。A04，A02和D05等染色體上的峰值SNPs與已報道QTLs重疊，在A10染色體上關聯得到一個在三種環(huán)境條件下穩(wěn)定存在的抗性位點VwRL3。SNPs有效性分析顯示，含有利SNP基因型的品種抗性明顯較強，有利SNPs數量越多抗性越強，說明黃萎病抗性具有顯著的聚合作用。單體型塊圖分析確定了一個372kb的候選區(qū)間，該區(qū)間為一

4、個抗病基因富集區(qū)，包含22個候選基因。
　　分別對VwRL3位點內候選基因VIGS沉默分析顯示只有GhTNL1基因單獨沉默植株接菌后出現嚴重的黃萎病癥狀?？?、感材料中GhTNL1基因表達模式分析表明，該基因在大麗輪枝菌侵染后6-24h表達強烈，這與大麗輪枝菌在6-24h是侵染寄主的關鍵時期相吻合。擬南芥(Arabidopsis thaliana)接種大麗輪枝菌后表型鑒定顯示，過表達株系(OE1)、異源回補株系(EC1)與野生型(C

5、ol-0)、突變體（tnll）相比，植株葉片黃化、萎蔫等現象得到顯著緩解，生長緩慢現象也得到部分恢復，說明GhTNL1基因能夠提高擬南芥對大麗輪枝菌的抗性。
　　分析發(fā)現GhTNL1基因含有典型的NB-ARC結構域和LRR重復基序，預測含有2個核定位信號，亞細胞定位顯示2個核定位信號均具有定位活性。qRT-PCR分析表明GhTNL1基因通過茉莉酸途徑行使其抗病功能。與Col-0及tnll相比，OE1和EC1中ROS積累及抗病相關(

6、PR)基因表達顯著增加。抗、感不同材料中GhTNL1多態(tài)性分析顯示在第225位處存在氨基酸G/R變異，該位點位于NB-ARC結構域P-loop保守基序內。為驗證該變異位點作用，分別將GhTNL1R（抗病基因型）和GhTNL1S（感病基因型）在本氏煙（Nicotiana benthammna）葉片中瞬時表達，發(fā)現GhTNL1S誘導ROS積累和PR基因表達能力明顯減弱。因此推測，該位點變異是導致棉花不同品種對黃萎病抗、感性的分化的原因之一。