化痰祛濕活血方對非酒精性脂肪變肝細胞模型AMPK-ACC-CPT-1信號通路的影響.pdf

1、　　目的： 成功建立非酒精性脂肪變體外肝細胞模型,從細胞學層次及分子生物學水平探討化痰祛濕活血方對 AMPK/ACC/CPT-1 信號通路的調控作用以及對甘油三酯的干預作用,從而初步揭示化痰祛濕活血方對 NAFLD 體外肝細胞模型損傷的保護作用及其可能作用機制,為進一步研究提供理論依據。
　　材料與方法： 制作化痰祛濕活血方高中低三個劑量的藥物溶液,分別相當于成人正常用量的 20 倍、10 倍和 5 倍,多烯磷脂酰膽堿藥物溶液

2、相當于成人正常用量的10倍,然后以Wistar大鼠灌胃,抽取腹主動脈血制作藥物血清,90%RPMI 1640 培養(yǎng)液+10%胎牛血清培養(yǎng)人正常肝細胞 L02 細胞株,每 2~3 天傳代一次,將生長狀態(tài)良好的細胞分為正常組、模型組、化痰活血祛濕方高劑量組、中劑量、低劑量組以及多烯磷脂酰膽堿(易善復)藥物組六組；接種于六孔培養(yǎng)板中。除正常組外,其它各組以40ug/ml濃度的油酸作用于 L02細胞24小時,復制非酒精性脂肪變體外肝細胞模型,制

3、作細胞爬片,以油紅O染色確定造模成功后,正常組和模型組更換為正常胎牛血清培養(yǎng)液,治療組則對應地以含10%藥物血清的培養(yǎng)液即(10%藥物血清+90%RMPI1640培養(yǎng)液)干預24小時,干預結束后分別觀察各組細胞油紅O染色、檢測各組細胞內甘油三酯含量以及AMPK、ACC、CPT-1和AdipoR2 mRNA的表達情況。
　　結果：
　　1.油紅 O 染色：正常組細胞形態(tài)正常,輪廓清晰,細胞內未見紅色脂滴,細胞核著色較深

4、,清晰可見；模型組細胞明顯腫大,輪廓模糊,細胞內可見較多橘紅色脂滴,并出現脂滴融合現象,細胞核染色較淡；化痰活血祛濕方高劑量組細胞邊緣較模型組清晰,形態(tài)尚可,細胞內可見橘紅色脂滴,但明顯少于模型組,細胞核著色亦明顯較模型組細胞核深；中劑量組細胞邊緣模糊,細胞內仍可見少量橘紅色脂滴,較模型組量少,但與高劑量組差別不大；低劑量組細胞邊緣模糊,細胞內仍可見橘紅色脂滴；易善復組較模型組輪廓清晰,細胞內脂滴亦較模型組有所減少。
　　2.

5、甘油三酯含量：與正常組相比,模型組甘油三酯的含量明顯升高,具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；化痰活血祛濕方高劑量組較模型組相比,TG含量明顯降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；化痰祛濕活血方中劑量組、低劑量組及易善復對照組較模型組相比,TG含量均有所降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而中劑量組、低劑量組與易善復組之間 TG 含量變化差異不甚明顯,統(tǒng)計學上無明顯差異(P>0.05)；化痰活血祛濕方中、低劑量組之間的TG含量亦無明顯

6、差異,結果無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3.AMPK mRNA的表達情況： 模型組AMPK mRNA較正常組表達下降,具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)；化痰祛濕活血方高劑量組、中劑量組、低劑量組及易善復組表達均較模型組增高,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中劑量組與低劑量組較正常組細胞表達增加具有顯著統(tǒng)計學意義( P<0.01),而化痰活血祛濕方高、中、低劑量組和易善復對照組之間經分析,結果無統(tǒng)計學意義。
　

7、　4.ACC mRNA的表達情況：與正常組相比,其他各組 ACC基因表達均有所降低,且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。較模型組,化痰祛濕活血方高劑量組、低劑量組和易善復組表達均有所降低,且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　5.CPT-1mRNA的表達情況：與正常組相比,化痰活血祛濕方各劑量組以及易善復組CPT-1表達均升高,較正常組具有顯著統(tǒng)計學意義( P<0.05),而模型組較正常組升高無統(tǒng)計學意義；中藥復方中、低劑量組

8、較模型組 CPT-1表達升高具有統(tǒng)計學意義,而與易善復組比較則無統(tǒng)計學意義。
　　6.AdipoR2 mRNA的表達情況：與正常相比,中藥各劑量組AdipoR2 mRNA表達有所降低,但無統(tǒng)計學意義,而易善復組 AdipoR2 mRNA表達明顯增加,較模型組具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01),同時,易善復組 AdipoR2的 mRNA表達增加較中藥各劑量組均有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1.40ug/ml