塞來(lái)昔布激活A(yù)kt-p53信號(hào)通路、減少肝細(xì)胞凋亡改善非酒精性脂肪性肝炎.pdf

1、背景及目的：
　　隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）的發(fā)病率迅速增加。目前關(guān)于NASH的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，如今被廣為接受的發(fā)病機(jī)制為“二次打擊”學(xué)說(shuō)。“首次打擊”為胰島素抵抗導(dǎo)致的肝脂肪變性，“第二次打擊”為氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及肝細(xì)胞凋亡等。已有報(bào)道稱肝細(xì)胞凋亡是NASH發(fā)展過(guò)程中“第二次打擊”的主要組成部分，因此，抑制肝細(xì)胞凋亡可能對(duì)改善和治療N

2、ASH有重要意義。塞來(lái)昔布是環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase2, COX-2）的特異性抑制劑，目前主要作為一種抗炎鎮(zhèn)痛藥廣泛應(yīng)用于臨床。研究表明，塞來(lái)昔布可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)改善NASH。然而塞來(lái)昔布可否通過(guò)抑制肝細(xì)胞凋亡從而改善NASH尚無(wú)定論。因此，本實(shí)驗(yàn)將使用蛋氨酸膽堿缺乏（Methionine and choline deficient, MCD）飼料誘導(dǎo)NASH小鼠模型，觀察塞來(lái)昔布對(duì)NASH小鼠模型中肝細(xì)胞凋亡的作用及

3、其潛在的分子機(jī)制，為臨床上有效治療NASH提供新的理論基礎(chǔ)和作用靶點(diǎn)。
　　材料和方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)小鼠采用C57BL/6J小鼠和COX-2基因敲除鼠。將野生型實(shí)驗(yàn)小鼠分成4組：對(duì)照組小鼠喂養(yǎng)對(duì)照飼料；MCD組小鼠僅喂養(yǎng)MCD飼料；MCD+CEL組小鼠在喂養(yǎng)MCD飼料的基礎(chǔ)上給予每天塞來(lái)昔布工作液進(jìn)行腹腔注射。MCD+CEL+MTF組則在MCD+CEL組處理的基礎(chǔ)上每天加用Akt特異性抑制劑米替福新進(jìn)行腹腔注射。而COX-

4、2基因敲除鼠則用僅MCD飼料喂養(yǎng)，定為MCD（KO）組。全部小鼠處理3周后行心臟采血后處死，取肝臟組織做冰凍切片、固定包埋及-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2.采用油紅O染色和HE染色觀察各組小鼠肝組織的脂質(zhì)堆積情況并作比較。
　　3.采用TUNEL-FITC試劑盒檢測(cè)各組小鼠模型中肝細(xì)胞凋亡，并計(jì)算凋亡指數(shù)。
　　4.采用甘油三脂（triglyceride, TG）試劑盒檢測(cè)各組小鼠的肝TG含量，采用谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanin

5、e transaminase, ALT）試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清ALT水平。
　　5.采用前列腺素2（Prostaglandin2, PGE2）ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠肝臟中PGE2的水平變化情況。
　　6. Western Blot檢測(cè)各組小鼠肝組織中Akt的磷酸化水平和p53的表達(dá)水平。
　　7.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和處理：用GraphPad Prism5.0軟件，所有數(shù)據(jù)均使用單因素方差分析的Newman-Keul's檢驗(yàn)

6、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.塞來(lái)昔布抑制NASH小鼠模型的肝細(xì)胞凋亡，改善肝脂質(zhì)堆積、降低血清ALT水平。
　　2.塞來(lái)昔布激活NASH小鼠肝臟組織中的Akt/p53信號(hào)途徑。
　　3.米替福新減弱塞來(lái)昔布的抗凋亡效應(yīng)，加重肝脂質(zhì)堆積、升高血清ALT水平。
　　4.米替福新抑制塞來(lái)昔布對(duì)Akt/p53信號(hào)通路的活化作用。
　　5. COX-2基因缺失改善NASH的肝細(xì)胞凋亡及脂質(zhì)堆積。