GLP-1對(duì)非酒精性脂肪肝病大鼠的作用及對(duì)PKCε、TLR4-NF-κB信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：
　　本課題擬以高脂飲食12周誘導(dǎo)建立NAFLD的SD大鼠模型，予利拉魯肽干預(yù)4周后通過(guò)1）測(cè)定血清中血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、葡萄糖(GLU)、胰島素(insulin);2)測(cè)定肝勻漿中TG、TC;HE染

2、色觀察肝臟的脂肪變性程度;3)PKCεκ TLR4的mRNA表達(dá);4）PKCε、TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)。從而觀察該藥物對(duì)脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗的影響、病理變化，及胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)進(jìn)而來(lái)探討GLP-1對(duì)高脂飲食SD大鼠的治療作用及其可能的機(jī)制，以期為利拉魯肽成為治療NAFLD的新藥物提供理論證據(jù)。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的來(lái)源及分組:32只SPF級(jí)雄性S

3、D大鼠（體重約120 g±10）購(gòu)自中山大學(xué)，具有動(dòng)物合格證，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)將其分為2組實(shí)驗(yàn)組21只，正常對(duì)照組(normal control，NC組)11只。
　　2、建立NAFLD大鼠模型:實(shí)驗(yàn)組大鼠予高脂飼料（88％普通飼料+10％豬油+2％膽固醇）喂養(yǎng)12周，動(dòng)物統(tǒng)一自由進(jìn)食。12周后，對(duì)高脂飲食大鼠進(jìn)行模型鑒定:第12周末實(shí)驗(yàn)組和NC組分別隨機(jī)抽取1只大鼠，禁食12h后，水合氯醛麻醉后抽取

4、靜脈血10mL全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清TG、TC、AST、ALT。處死后取出肝臟病理切片HE染色觀察肝組織脂肪變情況，NAFLD模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)報(bào)道。
　　3、利拉魯肽干預(yù)方法:造模成功后，將實(shí)驗(yàn)組大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為2組，每組10只:模型對(duì)照組(high fat diet，HFD)予高脂飲食+腹腔注射等體積的無(wú)菌生理鹽水，GLP-1治療組(HFD+GLP-1)予高脂飲食+腹腔注射GLP-1注射液（0.6 mg/kg.d

5、）。
　　干預(yù)期間SD大鼠自由飲食飲水，分成6籠，每籠5-6只，溫度20℃-25℃，動(dòng)物室內(nèi)照明設(shè)置為明暗各12小時(shí)左右。注意觀察大鼠的毛發(fā)改變，食欲、大小便、活動(dòng)、體重等變化情況，根據(jù)大鼠體重并按0.6 mg/kg.d標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整每日注射量。第16周末，所有大鼠禁食12h，禁水6h后，水合氯醛麻醉后抽取靜脈血10 mL，并取肝臟組織，一部分液氮速凍后存放于-80℃低溫冰箱備用，另留取部分肝組織10％中性甲醛浸泡固定備用。
　　

6、4、肝指數(shù)麻醉前稱(chēng)取大鼠的體重(g)，取出肝臟后予0.9％生理鹽水漂洗后稱(chēng)取肝重(g)，肝指數(shù)=肝重/體重×100％。
　　5、血液處理及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè):血液標(biāo)本常溫靜置30 min，3500r/min離心15 min后取上層血清至1.5 mL EP管中并做好標(biāo)記，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清的ALT、AST、TG、TC，用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清的GLU;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法測(cè)定血清胰島素(fasting insulin，F(xiàn)IN

7、)，胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，計(jì)算公式為:(FPG×FIN)/22.5(FPG單位為mmol/L; FIN單位為μIU/mL)。
　　6、10％肝勻漿制備及相關(guān)指標(biāo)測(cè)定:稱(chēng)取肝右葉中央部位組織100mg，冰凍生理鹽水漂洗后加入1.9ml勻漿介質(zhì)，冰浴下使用勻漿器勻漿(2000r/min)5min后離心吸取上清即為10％肝勻漿。使用GPO-PAP法檢測(cè)勻漿中的TG TC。
　　7、石蠟包埋肝組織做病理切片及HE染色:取

8、大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肝組織，用10％中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片機(jī)切厚度為5μ m的片子，HE染色，光鏡下觀察肝臟形態(tài)學(xué)的改變并對(duì)脂肪變性進(jìn)行評(píng)估，每張切片觀察5個(gè)視野，根據(jù)光鏡下每面積見(jiàn)的肝脂肪病變對(duì)肝臟脂肪變性程度分級(jí):正常(-):肝小葉結(jié)構(gòu)良好，基本無(wú)脂肪病變;輕度(+):小于1/3肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變;中度(++):即1/3-2/3以上的肝細(xì)胞脂變;重度(+++):即大于2/3肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變。<

9、br>　　8、RT-PCR法測(cè)定肝組織PKCε、TLR4的mRNA表達(dá):取出冰凍肝組織，解凍后冰凍生理鹽水洗凈血液后稱(chēng)取50-100 mg肝組織研缽中液氮下磨成粉末狀轉(zhuǎn)移至無(wú)酶EP管中，加入1 mL TRIZOL吹打混勻，冰上靜置10 min加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15s，靜置3 min，4℃1200×g離心15 min;取上清加入等體積異丙醇，靜置5 min4℃1200×g離心15 min;棄上清加入1mL75％乙醇充分洗滌沉淀

10、后4℃1200×g離心8 min;室溫干燥，加入30-70μL DEPC水溶解沉淀。進(jìn)行RNA濃度測(cè)定后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR檢測(cè)PKCεmRNA表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參。每個(gè)樣本重復(fù)3次，每次包括3個(gè)不加cDNA模板的陰性對(duì)照和只加DEPC水的空白對(duì)照。取ct平均值，采用相對(duì)定量法分析結(jié)果，以2-ΔΔCt方法判定模型組及GLP-1干預(yù)組相對(duì)于空白對(duì)照組肝組織中PKCε基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。Ct代表目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

11、，△△Ct=(CtPKCε/TLR4—CtGAPDH)處理組一(CtPKCε/TLR4—CtGAPDH)對(duì)照組。
　　9、Western blot測(cè)定肝組織胞漿PKCε、 TLR4蛋白表達(dá):取適量肝組織液氮下研磨成粉末，加入1 mL漿蛋白抽提液冰上裂解1h。4℃14000×g離心30 min取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PVDF電泳，60 V恒壓30 min，110V恒壓60 min。采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(

12、250mA，150 min);5％脫脂奶封閉2h;PKCε兔多克隆抗體(1∶500)購(gòu)自Abcam，TLR4兔多克隆抗體(1∶200)購(gòu)自Santa Cruz4℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗（羊抗兔1∶3000）室溫孵育1h，ECL液進(jìn)行曝光，使用FluorChem8900軟件對(duì)結(jié)果灰度值進(jìn)行分析。
　　10、免疫組化檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá):10％中性甲醛固定肝組織后進(jìn)行石蠟包埋，石蠟切片脫蠟至水洗，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加NF-κB

13、兔多抗(1∶100)購(gòu)自Santa Cruz，加Ⅱ抗（羊抗兔1∶100），DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，光鏡下觀察，每張切片取5個(gè)高倍鏡視野（每個(gè)視野＞500個(gè)細(xì)胞），分別計(jì)算陽(yáng)性率，陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％。
　　11、數(shù)據(jù)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差;多組間的比較，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊者（P＞0.05）用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較，

14、方差不齊者(P＜0.05)采用Welch校正法，組間兩兩比較用Dunnett's T3法。等級(jí)資料采用Kruskal-Wallis H非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、各組大鼠肝指數(shù)的變化
　　與 NC組比，HFD組的肝指數(shù)明顯升高(30.96±3.46versus23.02±1.52，p＜0.05);與HFD組相比，GLP-1給藥4周后，HFD+GLP-1組的肝指數(shù)顯著降低(

15、27.53±3.23 versus30.96±3.46,P＜0.05)。
　　2、各組大鼠血清ALT、AST、TG、TC的變化
　　與NC組比，HFD組血清的ALT、AST、TG、TC明顯升高（(87.14±19.04 versus67.00±17.64,176.14±30.04 versus98.00±44.37,1.94±0.76 versus0.62±0.23,2.44±0.25versus1.30±0.12，2.44

16、±0.25versus1.30±0.12，P＜0.05）;與HFD組比，給藥4周后，HFD+GLP-1組血清的ALT、AST、TG、TC均明顯減低（59.00±15.82versus87.14±19.04,124.25±24.52 versus176.14±30.04,1.35±0.54 versus1.94±0.76,2.05±0.23versus2.44±0.25,P＜0.05）。
　　3、各組大鼠10％肝勻漿中TG、TC的變

17、化
　　與NC組比，HFD組肝勻漿中的TG、TC明顯升高（2.89±0.19 versus1.74±0.22，2.20±0.22 versus1.30±0.12，P＜0.05）;與HFD組比，給藥4周后，HFD+GLP-1組肝勻漿中的TG、TC均明顯減低（1.35±0.54 versus2.89±0.19，1.17±0.16 versus2.20±0.22,P＜0.05）。
　　4、各組大鼠病理學(xué)觀察脂肪變情況
　　與

18、NC組比較，HFD組大鼠肝臟脂肪變程度明顯增加(P＜0.05），GLP-1干預(yù)4周后，大鼠肝臟脂肪變程度明顯減低恢復(fù)至正常（P＜0.05）。
　　5、各組大鼠胰島素及胰島素抵抗指數(shù)的變化
　　與NC組相比，HFD組大鼠血清胰島素升高(P＜0.05）。GLP-1治療4周后，大鼠血清胰島素降低（P＜0.05）。
　　6、各組大鼠肝組織PKCε的mRNA表達(dá)變化
　　HFD組較NC組表達(dá)下降(P＜0.05)，HFD+G

19、LP-1組較HFD組表達(dá)升高(P＜0.05)。
　　7、各組大鼠肝組織PKCε的蛋白表達(dá)變化
　　與NC組相比，HFD組較表達(dá)下降(P＜0.05)，而HFD+GLP-1組較HFD組表達(dá)升高(P＜0.05)。
　　8、各組大鼠肝組織TLR4的mRNA表達(dá)變化
　　HFD組較NC組表達(dá)升高(P＜0.05)，而HFD+GLP-1組較HFD組表達(dá)下降（P＜0.05）。
　　9、各組大鼠肝組織TLR4蛋白表達(dá)變化

20、r>　　HFD組較NC組表達(dá)升高(P＜0.05)，而HFD+GLP-1組較HFD組表達(dá)下降(P＜0.05)。
　　10、各組大鼠肝組織NF-κB表達(dá)變化
　　與NC組相比，HFD組NF-κB表達(dá)升高(P＜0.05)，而HFD+GLP-1組HFD組NF-κB表達(dá)下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、本課題以SD大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)12周的高脂飲食成功誘導(dǎo)建立NAFLD動(dòng)物模型，該模型具有具有代謝紊亂（高脂血癥

21、）及肝功能異常（轉(zhuǎn)氨酶升高）、病理組織學(xué)出現(xiàn)肝臟氣球樣變等特征，基本符合人類(lèi)NAFLD的自然病理生理演變過(guò)程。
　　2、GLP-1類(lèi)似物可改善NAFLD大鼠的脂質(zhì)代謝異常，同時(shí)可以逆轉(zhuǎn)由高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪變。
　　3、GLP-1類(lèi)似物可改善NAFLD大鼠的胰島素抵抗，提高胰島素敏感性，該過(guò)程可能與PKCε有關(guān)。
　　4、GLP-1類(lèi)似物可降低NAFLD大鼠肝組織中TLR4及NF-KB蛋白的表達(dá)，對(duì)炎癥相關(guān)信號(hào)通路具