水葫蘆銨轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆及表達分析.pdf

1、氮素是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、氨基酸等多種物質(zhì)的組成部分，是植物生長最重要的礦質(zhì)元素之一。氮素缺乏是農(nóng)作物生長過程中存在的普遍現(xiàn)象，因此，大量施用氮肥是提高農(nóng)作物產(chǎn)量的主要手段，據(jù)統(tǒng)計全球每年氮肥施用量約1億噸，由此帶來的資源浪費、環(huán)境污染等問題非常嚴重。目前，提高農(nóng)作物氮素利用率的方法主要通過改進施肥方式及作物輪作等手段來實現(xiàn)，但并未從根本上解決作物氮素吸收率低下及大量施肥所帶來的問題。大家都知道植物氮素的吸收利用與其自身基因有關，相關的銨轉(zhuǎn)

2、運蛋白主導著植物對外界環(huán)境中銨態(tài)氮的吸收，如果找到一種高效氮素吸收基因，并結(jié)合基因工程技術則很可能實現(xiàn)作物氮素吸收率的提高。
　　 隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，水體富營養(yǎng)化日益嚴重，水體氮磷營養(yǎng)鹽過度積累，造成沉水植被衰退和消亡，水生植物群落結(jié)構趨向單一化，水生生態(tài)環(huán)境失去平衡。水葫蘆具有過度吸收氮磷營養(yǎng)元素的特點，研究表明利用水葫蘆進行水體修復可以降低富營養(yǎng)化水體營養(yǎng)鹽濃度，提高水體透明度，提高水體中溶解氧含量，為沉水植被的生存創(chuàng)造有利

3、的環(huán)境，能起到明顯改善水質(zhì)的效果。對水葫蘆氮素吸收機理的研究可以從分子水平上揭示水葫蘆進行水體修復的機制。水葫蘆因其超強的繁殖能力，能在適度適宜的各種水體中旺盛生長，帶來一系列的經(jīng)濟、環(huán)境問題，目前很多物理、生物防治方法似乎都不怎么湊效，若從水葫蘆的營養(yǎng)代謝出發(fā)對水葫蘆氮素吸收機制深入研究，從而有效控制水葫蘆的生理生化狀況，也不失為一條防治水葫蘆的新途徑。
　　 本文基于水稻、小麥等植物中銨轉(zhuǎn)運蛋白(AMT，ammonium t

4、ransporter)基因保守序列，以水葫蘆根部RNA為模板經(jīng)過兩步法RT-PCR法擴增出水葫蘆根部銨轉(zhuǎn)運蛋白基因的保守序列片段，再經(jīng)RACE(Rapid-amplification of cDNAends)法，克隆了水葫蘆中第一個完整的銨轉(zhuǎn)運蛋白基因(Eichhornia crassipesammonium transporter，EcAMT)。EcAMT cDNA全長1600bp，共編碼501個氨基酸，軟件預測其具有9個跨膜域，與小

5、麥等植物具有較高的同源性，約達80％。通過BLAST分析及進化樹構建可知EcAMT屬于植物AMT1。
　　 將利用高保真酶擴增的EcAMT全長基因連接到穿梭質(zhì)粒pYES2，然后將該重組子轉(zhuǎn)化酵母突變株31019b（該突變株無法在銨離子作為唯一氮源且其濃度低于5mM的YNB培養(yǎng)基中生長），通過酵母突變互補功能鑒定實驗表明，轉(zhuǎn)化了該基因的酵母突變株能在低于5mM的銨離子濃度下正常生長，且其生長情況要優(yōu)于野生菌，表明該基因具有較高的銨

6、態(tài)氮吸收能力。
　　 本實驗還通過半定量PCR及熒光定量PCR對清水、銨態(tài)氮及硝態(tài)氮三種不同培養(yǎng)條件下生長的水葫蘆根部三種銨轉(zhuǎn)運蛋白基因（分別標號為EcAMT1、AMT2、AMT3）的表達水平進行了分析，結(jié)果表明不同氮素形態(tài)下三種基因的表達情況各不相同，缺氮處理水葫蘆根部72h后，EcAMT1的表達呈現(xiàn)明顯的氮脅迫效應，但同時也具有時間效應性，即隨著時間的變化，相同處理條件下其表達水平會發(fā)生變化。對處理72h后的水葫蘆AMT2和