水葫蘆銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、氮素是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、氨基酸等多種物質(zhì)的組成部分，是植物生長(zhǎng)最重要的礦質(zhì)元素之一。氮素缺乏是農(nóng)作物生長(zhǎng)過(guò)程中存在的普遍現(xiàn)象，因此，大量施用氮肥是提高農(nóng)作物產(chǎn)量的主要手段，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年氮肥施用量約1億噸，由此帶來(lái)的資源浪費(fèi)、環(huán)境污染等問(wèn)題非常嚴(yán)重。目前，提高農(nóng)作物氮素利用率的方法主要通過(guò)改進(jìn)施肥方式及作物輪作等手段來(lái)實(shí)現(xiàn)，但并未從根本上解決作物氮素吸收率低下及大量施肥所帶來(lái)的問(wèn)題。大家都知道植物氮素的吸收利用與其自身基因有關(guān)，相關(guān)的銨轉(zhuǎn)

2、運(yùn)蛋白主導(dǎo)著植物對(duì)外界環(huán)境中銨態(tài)氮的吸收，如果找到一種高效氮素吸收基因，并結(jié)合基因工程技術(shù)則很可能實(shí)現(xiàn)作物氮素吸收率的提高。
　　 隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，水體富營(yíng)養(yǎng)化日益嚴(yán)重，水體氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽過(guò)度積累，造成沉水植被衰退和消亡，水生植物群落結(jié)構(gòu)趨向單一化，水生生態(tài)環(huán)境失去平衡。水葫蘆具有過(guò)度吸收氮磷營(yíng)養(yǎng)元素的特點(diǎn)，研究表明利用水葫蘆進(jìn)行水體修復(fù)可以降低富營(yíng)養(yǎng)化水體營(yíng)養(yǎng)鹽濃度，提高水體透明度，提高水體中溶解氧含量，為沉水植被的生存創(chuàng)造有利

3、的環(huán)境，能起到明顯改善水質(zhì)的效果。對(duì)水葫蘆氮素吸收機(jī)理的研究可以從分子水平上揭示水葫蘆進(jìn)行水體修復(fù)的機(jī)制。水葫蘆因其超強(qiáng)的繁殖能力，能在適度適宜的各種水體中旺盛生長(zhǎng)，帶來(lái)一系列的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境問(wèn)題，目前很多物理、生物防治方法似乎都不怎么湊效，若從水葫蘆的營(yíng)養(yǎng)代謝出發(fā)對(duì)水葫蘆氮素吸收機(jī)制深入研究，從而有效控制水葫蘆的生理生化狀況，也不失為一條防治水葫蘆的新途徑。
　　 本文基于水稻、小麥等植物中銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AMT，ammonium t

4、ransporter)基因保守序列，以水葫蘆根部RNA為模板經(jīng)過(guò)兩步法RT-PCR法擴(kuò)增出水葫蘆根部銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的保守序列片段，再經(jīng)RACE(Rapid-amplification of cDNAends)法，克隆了水葫蘆中第一個(gè)完整的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(Eichhornia crassipesammonium transporter，EcAMT)。EcAMT cDNA全長(zhǎng)1600bp，共編碼501個(gè)氨基酸，軟件預(yù)測(cè)其具有9個(gè)跨膜域，與小

5、麥等植物具有較高的同源性，約達(dá)80％。通過(guò)BLAST分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建可知EcAMT屬于植物AMT1。
　　 將利用高保真酶擴(kuò)增的EcAMT全長(zhǎng)基因連接到穿梭質(zhì)粒pYES2，然后將該重組子轉(zhuǎn)化酵母突變株31019b（該突變株無(wú)法在銨離子作為唯一氮源且其濃度低于5mM的YNB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)），通過(guò)酵母突變互補(bǔ)功能鑒定實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)化了該基因的酵母突變株能在低于5mM的銨離子濃度下正常生長(zhǎng)，且其生長(zhǎng)情況要優(yōu)于野生菌，表明該基因具有較高的銨

6、態(tài)氮吸收能力。
　　 本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)半定量PCR及熒光定量PCR對(duì)清水、銨態(tài)氮及硝態(tài)氮三種不同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的水葫蘆根部三種銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（分別標(biāo)號(hào)為EcAMT1、AMT2、AMT3）的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果表明不同氮素形態(tài)下三種基因的表達(dá)情況各不相同，缺氮處理水葫蘆根部72h后，EcAMT1的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的氮脅迫效應(yīng)，但同時(shí)也具有時(shí)間效應(yīng)性，即隨著時(shí)間的變化，相同處理?xiàng)l件下其表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化。對(duì)處理72h后的水葫蘆AMT2和