HSV-tk、IL-18聯(lián)合修飾骨髓基質干細胞治療腦膠質瘤的實驗研究.pdf

1、膠質瘤作為人類最常見的原發(fā)性顱內腫瘤，有很高的發(fā)病率和死亡率。約占成人顱內原發(fā)腫瘤的30％-50％。迄今的治療方法都不能從根本上改變這一致命腫瘤的自然轉歸，因而新療法的探索成為神經外科的熱點課題。近年來隨著膠質瘤分子生物學與分子遺傳學的發(fā)展，同時基因重組、基因轉染等技術的成熟，腫瘤基因治療成為研究的熱點，自殺基因治療是其中最常采用的方案。 理想的腦腫瘤的基因治療應該是應用最佳的基因轉移技術來轉移最佳的治療基因。自殺基因(HSV-

2、tk/GCV)治療腫瘤的體外及動物實驗均取得了驚人的效果，但臨床療效不能令人滿意，究其原因是基因治療的載體無法在體內腫瘤組織中進行廣泛分布，從而不能充分發(fā)揮其旁觀者效應。 膠質瘤患者均表現(xiàn)出了T淋巴細胞抗腫瘤作用的減弱，并且，由于膠質瘤細胞缺乏細胞表面抗原導致的腫瘤抗原呈遞作用的減弱，進一步減弱了抗腫瘤免疫?，F(xiàn)在的觀點認為，IL-18 可通過T淋巴細胞、NK 細胞發(fā)揮抗腫瘤作用，并且通過上調MHC分子的表達、促進CD4+輔助性T

3、細胞向Th1型亞單位的分化增強細胞免疫。 骨髓基質干細胞(BMSCs)是具有遷移能力的細胞，并可穩(wěn)定的表達外源性轉染的某些基因，為膠質瘤基因治療提供了新的思路。 本實驗擬用骨髓基質干細胞為載體，觀察轉染自殺基因的骨髓基質干細胞對腦膠質瘤的治療作用，再引入IL-18，增強抗腫瘤免疫，觀察兩者相結合的治療效果，為以骨髓基質干細胞為載體進行腦膠質瘤的基因治療提供理論依據。以骨髓基質干細胞為載體，HSV-tk與IL-18聯(lián)合治療

4、膠質瘤的研究，在國內外尚無報道。 1．骨髓基質干細胞的培養(yǎng)、鑒定及標記的研究 目的：研究骨髓基質干細胞的培養(yǎng)方法，并對其進行標記，為進一步的體內試驗奠定基礎。 方法：將出生2周的SD大鼠脫頸處死，消毒后取雙側股骨，自中間剪斷后沖出骨髓細胞，加入含20％胎牛血清的完全培養(yǎng)液于37℃、5％CO2孵箱內培養(yǎng)，48小時后半量換液。以后每2-3天半量換液，7-8天傳代一次。培養(yǎng)初期細胞較混雜，第6代后細胞形態(tài)為均一的紡錘形

5、細胞。MTT法繪制生長曲線。 將培養(yǎng)第6代、已純化的骨髓基質干細胞消化、計數(shù)后應用流式細胞術檢測BMSCs CD31、CD34、 CD45、CD90、CD44、CD71陽性率。取對數(shù)生長期的骨髓基質干細胞進行細胞爬片，待細胞生長至50％時加入BrdU(終濃度10μg/ml)，24小時后取出玻片用PBS洗滌，4％多聚甲醛固定15分鐘后進行免疫組化及免疫熒光染色，封片觀察。將BrdU標記的骨髓基質干細胞注入大鼠顱內，3周后處死大鼠取

6、腦，于穿刺點位置附近作石蠟切片并進行免疫熒光染色。 結果：在培養(yǎng)初期可見大量懸浮細胞，48 小時后可見有散在紡錘形貼壁細胞，經多次半量換液后，未貼壁細胞逐漸被去除。細胞初期多以集落形式生長，第6代后細胞呈形態(tài)均一的紡錘形，分布均勻。繪制細胞生長曲線，可見細胞呈一種持續(xù)的增殖狀態(tài)，培養(yǎng)2-3天后進入對數(shù)生長期。以流式細胞技術檢測細胞表面抗原，結果顯示為體積均一的細胞群，CD31、CD34、 CD45的陽性率分別為5.67％、4.3

7、1％、4.42％， CD90、CD44、CD71 的陽性率分別為97.17％、98.63％、95.86％。骨髓基質干細胞體外免疫組化顯示88.75±4.38％的細胞可被BrdU標記。免疫熒光染色可見胞核染色明顯，BrdU標記的骨髓基質干細胞注入體內后3周仍可見明顯的．BrdU著色，穿刺點位置可見密集的細胞。 結論：通過骨髓全細胞培養(yǎng)的方法可獲得高純度的BMSCs，并可在體外長期培養(yǎng)；采用BrdU標記骨髓基質干細胞具有較高的標記陽

8、性率，并且標記效果穩(wěn)定。 2．骨髓基質干細胞向腦膠質瘤的趨向性及神經轉化潛能 目的：在于研究骨髓基質干細胞向腦膠質瘤的趨向性，及骨髓基質干細胞在體外環(huán)境中、在特定細胞因子誘導條件下的細胞轉化，以及骨髓基質干細胞在腦膠質瘤環(huán)境中的轉化情況。 方法：體外培養(yǎng)6～7代的BMSCs接種到預置有多聚賴氨酸包被的蓋玻片的培養(yǎng)板內，細胞達到70％融合時，將蓋玻片轉移至含10％胎牛血清的Neurobasal培養(yǎng)基內培養(yǎng)，加入全反

9、式視黃酸(0.5μmol/L)、腦源性神經生長因子(10ng/mL)。以正常培養(yǎng)的、未加誘導劑的BMSCs作為對照。4d后，取出蓋玻片，4％多聚甲醛固定30min，用于免疫熒光檢測細胞轉化情況。 骨髓基質干細胞趨瘤性研究的體外實驗采用空心柱試驗及Transwell試驗。培養(yǎng)大鼠腦膠質瘤C6細胞，待細胞達到對數(shù)生長期時，消化計數(shù)，制作大鼠腦膠質瘤模型。模型建立3天后隨機抽取20只荷瘤大鼠，在腫瘤對側大腦立體定向種植BMSCs(8×

10、10<'4>個懸于2μLPBS)。移植后15d，4％多聚甲醛自大鼠心臟灌注后，取出腦組織制作病理切片。用于轉化研究的腦組織制作冰凍切片。 結論：骨髓基質干細胞具有明顯的向膠質瘤細胞遷移的特性，遷移細胞多聚集于腫瘤邊緣，只有少數(shù)骨髓基質干細胞可達到腫瘤內部；骨髓基質干細胞在體外特殊誘導環(huán)境中及移植到荷瘤大鼠腦內后，可部分轉化為神經前體細胞、神經元及膠質細胞。 3.轉染HSV-tk 的骨髓基質干細胞治療腦膠質瘤的體內、外實驗

11、研究 目的：在于探討以骨髓基質干細胞為載體，觀察轉染 tk 基因的骨髓基質干細胞對腦膠質瘤的殺傷作用。 方法：AdCMlV-tk 病毒擴增后用于感染骨髓基質干細胞，而后采用RT-PCR方法檢測BMSCs/tk對tk基因的轉錄。而后進一步采用流式細胞術、MTT檢測BMSCs/tk細胞表面抗原及生長曲線。Transwell試驗檢測BMSCs/tk 體外趨瘤性；制作大鼠腦膠質瘤模型，將BMSCs/tk 移植到腫瘤對側腦組織，觀

12、察其體內趨瘤性。將BMSCs/tk與 C6 細胞混合培養(yǎng)，采用不同的效靶比及不同的GCV濃度，用MTT法、TUNEL、AnnexinV檢測細胞存活率或凋亡率，觀察BMSCs/tk 的旁觀者效應。進一步采用體內試驗，觀察BMSCs/tk的體內旁觀者效應，觀察荷瘤大鼠在治療后的生存期改變。 結論：感染AdCMV-tk后， BMSCs可長時間的對tk基因進行轉錄；BMSCs/tk 具有明顯的顱內腫瘤趨向性，并保持旺盛的增殖活性；BMS

13、Cs/tk在體外及在腦膠質瘤荷瘤大鼠體內可誘導明顯的腫瘤細胞凋亡，延長荷瘤大鼠生存期。 4．HSV-tk、IL-18 聯(lián)合修飾骨髓基質干細胞治療腦膠質瘤的體內、外實驗研究 目的：是采用IL-18 轉染BMSCs，觀察BMSCs/IL-18 的抗腦膠質瘤效果；進一步采用IL-18及tk聯(lián)合修飾BMSCs，觀察BMSCs/IL-18/tk 的體內外抗腫瘤效果。 方法：LXSN/IL-18 感染骨髓基質干細胞(BMSC

14、s/IL-18)，篩選出陽性克隆后，感染AdCMV/tk病毒(BMSCs/IL-18/tk)，而后采用RT-PCR 方法檢測BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk對IL-18 基因、tk基因的轉錄。而后進一步采用流式細胞術、MTT 檢測BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk：細胞表面抗原及生長曲線。Transwell試驗檢測BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk體外趨瘤性；制作大鼠腦膠質瘤模型，

15、將BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk移植到腫瘤對側腦組織，觀察其體內趨瘤性。將BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk與C6細胞混合培養(yǎng)，采用不同的效靶比及不同的GCV濃度，用MTT法、TUNEL、AnilexinV 檢測細胞存活率或凋亡率，觀察BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk的旁觀者效應。進一步采用體內試驗，觀察BMSCs/IlL-18、BMSCs/IL-18/tk 的體內抗腦膠質瘤作

16、用。ELISA 法檢測BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk 對淋巴細胞分泌的影響。免疫組化方法檢測BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk 治療后腫瘤組織內部微血管密度、淋巴細胞浸潤、細胞凋亡情況。MRI檢測治療后的腫瘤體積改變，觀察荷瘤大鼠在治療后的生存期改變。 結論：轉染IL-18后，BMSCs/IL-18可穩(wěn)定轉錄及表達IL-18基因；感染AdCMV-tk后，BMSCs/IL-18/tk可穩(wěn)定的