tBHQ對無機砷致人皮膚角質細胞凋亡的作用及機制研究.pdf

1、砷是一種常見的環(huán)境毒物，長期暴露于無機砷存在的環(huán)境中可以引起人體多系統(tǒng)和器官的疾病，砷暴露對地方性砷中毒病區(qū)的居民健康生活和經(jīng)濟發(fā)展造成嚴重的影響。大量砷對皮膚角質細胞影響的體內(nèi)體外研究均已證實，無機砷暴露能夠誘導人皮膚角質細胞凋亡，影響細胞的正常增殖和引起細胞損傷。
　　 細胞凋亡是一種有序或程序性的細胞死亡方式，受基因調(diào)控的細胞主動性死亡過程，是細胞核受某些特定信號刺激后進行的生理應答反應，所以細胞凋亡又被稱為細胞程序性死亡

2、。機體正常的細胞凋亡過程調(diào)節(jié)失控，機體會失去穩(wěn)定性而引發(fā)人類腫瘤、免疫系統(tǒng)損傷等多種疾病。一般認為，細胞凋亡的發(fā)生主要存在兩條信號通路的調(diào)控機制，分別為線粒體通路（內(nèi)部）和死亡受體通路（外部）。研究表明，在線粒體通路中，ROS的堆積可以導致線粒體膜脂質過氧化和功能受損，造成質子電化學梯度耗散，△Ψm降低，引起線粒體膜的破裂和蛋白質活性物質如CytC釋放，繼之Caspase瀑布式活化，最終引起細胞凋亡。
　　 叔丁基對苯二酚(tB

3、HQ)是一種常見的抗氧化劑，有研究發(fā)現(xiàn)，在PC12細胞和神經(jīng)系統(tǒng)細胞中，tBHQ可以通過線粒體途徑發(fā)揮抗凋亡作用，而且能夠影響凋亡相關蛋白Bcl-2家族蛋白的表達。另外，tBHQ是Nrf2轉移入核的強烈誘導劑，具有極強的抗氧化作用，因此，tBHQ可以通過提高細胞的抗氧化水平從而發(fā)揮保護細胞的作用。但是目前，tBHQ對砷誘導的角質細胞凋亡的可能影響尚未見報道。
　　 綜上所述，本研究擬選用人永生化表皮細胞HaCaT細胞系，探討tB

4、HQ在無機砷誘導HaCaT細胞凋亡過程中的作用，觀察tBHQ對內(nèi)源性線粒體凋亡通路和凋亡相關蛋白Bcl-2等蛋白表達的影響，試圖揭示可能的機制。本研究將為預防和治療無機砷誘導的皮膚氧化損傷效果等提供新的實驗依據(jù)和線索。
　　 研究方法
　　 1.Annexin V/PI雙染流式細胞儀法測定細胞凋亡率
　　 2.熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變
　　 3.JC-1染色流式細胞儀法測定線粒體膜電位改變
　　

5、 4.分光光度法檢測Caspase-3蛋白活力
　　 5.Western blot法分析細胞內(nèi)Caspase-3、CytC、Nrf2、Bcl-2和Bax蛋白表達水平
　　 結果
　　 1.tBHQ對NaAsO2致HaCaT細胞凋亡的拮抗作用
　　 形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，tBHQ50μmol/L預處理12 h后再暴露于NaAsO2(5，30μmol/L)細胞中凋亡細胞數(shù)，細胞核碎片和凋亡小體均減少。Annexin

6、 V/PI雙染流式細胞儀測定細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，NaAsO2(10和30μmol/L)單獨作用HaCaT細胞，細胞凋亡率隨染砷濃度增加而升高，差異具有顯著性(p＜0.01)。而tBHQ(10、25、50μmol/L)預處理后，細胞凋亡率與相同濃度NaAsO2單獨作用組相比明顯降低，且差異具有統(tǒng)計性(p＜0.01或p＜0.05)。
　　 此外，NaAsO2單獨作用HaCaT細胞，JC-1染色法流式細胞儀測定細胞線粒體膜電位破壞率隨染砷

7、濃度增加而升高，差異具有顯著性(p＜0.01)。給予tBHQ預處理后，線粒體膜電位破壞率與相同濃度NaAsO2單獨作用組相比明顯恢復，且差異具有統(tǒng)計性(p＜0.01或p＜0.05)。
　　 對凋亡相關蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，NaAsO2單獨作用于HaCaT細胞24 h，線粒體中CytC蛋白表達降低，而胞漿中Cyt C蛋白表達則隨染砷劑量的增加而明顯升高。tBHQ預處理12h后再分別暴露于NaAsO2，線粒體中CytC蛋白表達明顯恢復，胞漿

8、中Cyt C蛋白表達則隨tBHQ劑量的增加而明顯回落。此外，NaAsO2單獨作用于HaCaT細胞24 h，procaspase-3蛋白表達降低，而Caspase-3活化程度均顯著高于對照組(p＜0.01)，tBHQ預處理12h后再暴露于NaAsO2，procaspase-3蛋白表達均明顯高于相同濃度砷單獨作用組，而且Caspase-3酶活力得到明顯抑制，差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.01)。
　　 2.tBHQ對N

9、aAsO2致HaCaT細胞內(nèi)Nrf2蛋白表達的影響
　　 tBHQ單獨作用可誘導HaCaT全細胞Nrf2和細胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達，且均明顯高于對照組。tBHQ預處理再與NaAsO2共同處理，Nrf2蛋白表達均明顯高于相同濃度NaAsO2單獨作用組。
　　 3.tBHQ對NaAsO2致HaCaT細胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白表達的影響
　　 NaAsO2單獨作用于HaCaT細胞24h，與對照組相比Bcl-2蛋白表達

10、降低，而Bax蛋白表達明顯升高。tBHQ預處理12 h后再分別暴露于NaAsO2，Bcl-2蛋白表達明顯恢復，而Bax蛋白表達則隨tBHQ劑量的增加而明顯回落。
　　 結論：
　　 1.tBHQ對無機砷致人皮膚角質細胞細胞凋亡具有一定的拮抗作用。
　　 2.tBHQ能夠影響線粒體凋亡途徑拮抗NaAsO2誘導的人皮膚角質細胞凋亡。
　　 3.tBHQ能夠誘導核因子Nrf2和調(diào)控凋亡相關蛋白Bcl-2/Bax